УДК 616-097-085.37
О.И. Летяева, О.А. Гизингер, И.И. Долгушин
Научный руководитель: Долгушин И.И., д.м.н., член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель наук, профессор ГОУВПО «ЧелГМА Росздрава» г. Челябинск, Россия
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ БАКТЕРИЦИДНОСТИ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПО ФОРМИРОВАНИЮ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ЛОВУШЕК
Актуальность
Одной из важнейших функций нейтрофила является антимикробная защита. Бактерицидные факторы нейтрофильного гранулоцита (НГ) принято изучать с помощью комплекса методов, одним из которых является метод НСТ-теста, при котором проводится оценка внутриклеточного кислородзави-симого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов. Метод основан на учете интенсивности восстановления клетками нитросинего тетразоля (НСТ) в его нерастворимую форму - диформазан. В 2004 году Arturo Zychlinsky был предложен новый механизм осуществления внеклеточной бактерицидности НГ- нейтрофильные внеклеточные ловушки (НВЛ), которые представляют собой сетеподобные структуры, формирующиеся во экстрацеллюлярном пространстве, состоящие из нуклеиновых кислот и ферментов. Изучение метода формирования НВЛ позволит нам углубить наши знания о бактерицидных свойствах нейтрофила и его роли в осуществлении антимикробной защиты и возможно в осуществлении клеточной цитотоксичности.
Цель исследования - определение бактерицидности нейтрофилов на основе метода нейтро-фильных внеклеточных ловушек.
Материалы и методы. Эксперимент in vitro был проведен на нейтрофилах, выделенных из периферической крови человека, методом дифференциального центрифугирования на двойном градиенте плотности фиколл-верографин (плотность = 1,077 и 1,093 г/см). Выход нейтрофилов 90-95 %. Взвесь нейтрофилов в концентрации 5х106/мл активировали взвесью микроорганизмов (S. aureus, Lactobacteria spp., Bifidumbacteria bifidum, E. coli, C. albicans), затем инкубировали в термостате при температуре +37оС в течении 30 мин. После инкубации препарат наносился на предметное стекло, фиксировался этиловым спиртом и окрашивался раствором красителя акридинового оранжевого. Результат оценивался при помощи люминесцентной микроскопии. В качестве контроля выступала чистая фракция нейтрофилов в концентрации 5 х 106 /мл окрашенная аналогичным способом.
Полученные результаты. В контрольных пробах количество НВЛ составляло в среднем 4 % от общего числа нейтрофилов. Во фракции нейтрофильных лейкоцитов активированных взвесью смеси микроорганизмов количество НВЛ выросло до 33% от общего числа клеток.
Выводы. Наряду с традиционными методами определения бактерицидности нейтрофильных гранулоцитов (НСТ- тест) появляется возможность использования метода, основанного на изучении количества нейтрофильных внеклеточных ловушек.
УДК 616-097-085.37
О.И. Летяева, О.А. Гизингер, И.И. Долгушин
Научный руководитель: Долгушин И.И., д.м.н., член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель наук, профессор ГОУ ВПО «ЧелГМА Росздрава» г. Челябинск, Россия
ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ПРОЦЕСС ФОРМИРОВАНИЯ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ЛОВУШЕК
Значимость нейтрофильных гранулоцитов (НГ) в системе иммунитета в настоящее время не подвергается сомнению. Нейтрофилы рассматриваются как основные клетки, играющие ведущую роль в противоинфекционной защите организма благодаря своей способности поглощать патогенны, высвобождать широкий спектр противомикробных компонентов[3]. Нейтрофилы, традиционно, относятся к фагоцитирующим клеткам и являются первой линией защиты иммунной системы организма от патогенных микроорганизмов, перемещаются из ткани в ткань по направлению к очагам инфицирования и воспаления. Благодаря ряду уникальных свойств они рассматриваются как высокопрофессиональные
«убийцы», составляющие своеобразный «отряд быстрого реагирования» в системе противоинфекцион-ной защиты организма.
В 2004 году Arturo Zychlinsky был открыт механизм уничтожения патогенов нейтрофилами, который заключается в способности активированных клеток "выбрасывать" сетевидные образования, в которых задерживаются, нейтрализуются, а затем и погибают микроорганизмы. Эти новые структуры получили название нейтрофильных экстрацеллюлярных ловушек (NET-Neutrophil Extracellular Traps).
Нейтрофильные внеклеточные ловушки (НВЛ) представляют собой очень тонкие нити, определяемые только с помощью электронной микроскопии. Вместе с небольшими глобулами они образуют более сложные структуры. Одним из компонентов НВЛ является хроматин. Это смесь ДНК и белков, которая является источником генетической информации и находится в клеточном ядре. Основными белками хроматина являются гистоны, которые отвечают за целостность структуры ДНК и принимают участие в разрушении микроорганизмов. НВЛ содержат также и гранулы нейтрофильных белков, принимающих участие в обезвреживании микроорганизмов[1,2]. Микроорганизмы попадают в эти ловушки и погибают в них. Взаимодействие с бактериями особым образом активизирует нейтрофил, при этом изменяется структура ядра клетки и содержащихся в нем гранул. Ядерная мембрана разрушается, гранулы растворяются, и компоненты будущей ловушки распределяются по объему клетки. Далее клетка сокращается до тех пор, пока ее мембрана не лопнет, и быстро выбрасывает высокоактивную смесь наружу. Попав во внеклеточное пространство, содержимое клетки формирует своеобразную сеть, в которую и попадают бактерии.
НВЛ эффективны в борьбе с патогенными и условно-патогенными микроорганизмами. Количество погибающих в сетях бактерий сопоставимо с количеством микроорганизмов, уничтожаемых ней-трофилом при жизни.
В большинстве стран мира лазер все шире применяется в медицине в лечебных целях, поскольку изучение свойств лазерного луча открыло широкие возможности для его локального и системного применения. Исследования последнего десятилетия в области изучения физических воздействий на иммунокомпетентные клетки доказали, что низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ) стимулирует изменения биологических объектов, реализация которых осуществляется на субклеточном и клеточном уровне организации живой материи[6]. Экспериментальные и клинические исследования влияния лазерного воздействия свидетельствуют об изменении энергетической активности и конформаци-онного состояния мембран клетки, перестройке ядерного аппарата, активации основных ферментных систем, биосинтетических и окислительно-восстановительных процессов в нейтрофиле. Под действием лазера происходят структурно-функциональные преобразования межклеточного пространства, увеличение продукции макроэргических соединений. Исследования по изучению функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов в крови и биологических секретах показали, что при облучении ней-трофилов, выделенных из периферической крови человека, наблюдается повышение их фагоцитарной и секреторной активности, при этом происходит активизация процессов как по кислородзависимому, так и по кислороднезависимому пути [5,6]. Усиление секреторной активности нейтрофильных грану-лоцитов приводит к увеличению содержания лизосомальных и катионных белков в клетках.
Из вышеизложенного следует, что лазер непосредственно стимулирует функциональную активность нейтрофилов, влияя на процессы фагоцитоза. Однако исследования о влиянии физических факторов, в том числе лазерного излучения низкой интенсивности на формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек до настоящего времени не проводилось.
Целью настоящей работы является изучение воздействия низкоинтенсивного лазерного на процесс формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек в крови человека.
Материалы и методы. Объектом исследования были нейтрофильные гранулоциты, выделенные из периферической венозной крови здоровых доноров в возрасте 18-35 лет.
Гепаринизированную венозную кровь (25 ЕД на 1 мл крови) смешивали с раствором натрия хлорида 0,9 % в равных объемах. Затем выделяли нейтрофилы на градиенте двойной плотности фиколла-верографина (плотность = 1,077 и 1,093 г/см), клетки осаждали центрифугированием в течение 45 мин при 1500 об/мин, далее дважды отмывали раствором натрия хлорида 0,9 %. Выход нейтрофилов составлял 90-95 %. Нейтрофильную взвесь доводили до объема 1 мл и стандартизировали до концентрации 5х106/мл путем подсчета количества клеток под световым микроскопом в камере Горяева. Ней-трофильные лейкоциты облучали лазером низкой интенсивности в силиконизированных пластмассовых одноразовых чашках Петри диаметром 40 мм в количестве 1 мл. Лейкоциты облучали сверху в течение 4 мин He-Ne-лазером («УРАЛ-И»). Применялся непрерывный режим излучения, длинна волны 632 нм, частота излучения лазера 80 Гц, мощность лазера 50 Вт. Облучение производили в светоизоли-рованной камере при температуре 36,6°С. Контрольные пробы подвергали темновой инкубации при аналогичных условиях без облучения He-Ne-лазером.
Нейтрофильную взвесь наносила на предметное стекло, фиксировали 96% этиловым спиртом и окрашивался раствором красителя акридинового оранжевого. Результаты оценивались при помощи люминесцентной микроскопии. В мазках подсчитывалось процентное содержание нейтрофилов с сегментированным ядром, нейтрофилов с недифференцированным ядром и нейтрофильных внеклеточных ловушек. Полученные результаты исследования были обработаны методами вариационной статистики с вычислением средней арифметической и ее стандартной ошибки (М ± м). Для расчетов применялся непараметрический критерий Манна-Уитни. Обработка материала производилась методом вариационной статистики с помощью пакета прикладных программ "Statistic for Windows"
Результаты и обсуждение.
Для выявления влияния НИЛИ на процесс формирования НВЛ у нейтрофильных лейкоцитов была сформирована экспериментальная группа, в которую вошли 36 человека в возрасте от 18 до 35 лет.
При облучении нейтрофильных гранулоцитов НИЛИ с переменой генерацией импульса (длина волны 632 нм, частота- 80 Гц, мощность - 50 Вт) в течении 4 мин формируется 22% нейтрофильных внеклеточных ловушек от общего числа нейтрофилов, в интактных нейтрофилах процент НВЛ составил 7%. Также отмечалось увеличение числа нейтрофилов с недифференцированным ядром во взвеси нейтрофильных гр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.