ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2008, № 1, с. 53-60
ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА
УДК 612.821:615.214
ОТСТАВЛЕННОЕ ВЛИЯНИЕ ЭКЗОРФИНОВ НА ОБУЧЕНИЕ
ДЕТЕНЫШЕЙ БЕЛЫХ КРЫС
© 2008 г. В. А. Дубышин*, И. В. Малиновская*, Ю. А. Беляева*, И. С. Стоволосов*, Ж. Д. Беспалова*, Л. А. Андреева**, А. А. Каменский*, Н. Ф. Мясоедов**
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет,
119992 Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12 **Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Курчатова, 2
E-mail: dva-msu@yandex.ru Поступила в редакцию 06.12.2006 г
Исследовано отставленное действие хронически вводимых на 1-14-е сут жизни опиоидных пептидов экзогенного происхождения (экзорфинов) на обучение детенышей белых крыс. Показано, что геп-тапептид YPFPGPI ф-казоморфин-7), пентапептид YPLDL (рубисколин-5) и пентапептид YPISL (эк-зорфин С) ускоряли выработку пищедобывательного навыка в тесте "сложный лабиринт". Лишенный N-концевого тирозина гексапептид PFPGPI был неэффективен. На формирование условного рефлекса пассивного избегания воздействовал (в сторону ухудшения) только Р-казоморфин-7. Полученные результаты свидетельствуют о способности экзорфинов (в особенности имеющих молочное происхождение Р-казоморфинов) значимо и в течение длительного времени влиять на адаптацию детенышей млекопитающих к условиям окружающей среды.
Обучение входит в круг наиболее сложных процессов, реализуемых высокоорганизованным мозгом, и позволяет резко повысить индивидуальную приспособленность особи к условиям окружающей среды. При этом для эффективного обучения требуется совместная деятельность многих нейромедиаторных систем и нервных структур. Анализируя процессы обучения в центральной нервной системе (ЦНС), мы сталкиваемся с чрезвычайно широким кругом явлений, в результате чего объектами исследований оказываются как ассоциативные (условнорефлектор-ные), так и неассоциативные феномены, связанные с различными по механизмам типами памяти. В представленной работе внимание сконцентрировано лишь на одном из аспектов обучения - выработке навыков с различными типами подкрепления. Основной целью стало определение специфики отставленного действия экзорфинов (опиоидных пептидов экзогенного происхождения), повторно вводимых детенышам белых крыс в первые сутки их жизни.
Наиболее известными представителями семейства экзорфинов являются Р-казоморфины -фрагменты Р-казеинов молока многих видов млекопитающих (в том числе, человека). Благодаря ^концевой последовательности Tyr-Pro-Phe, Р-ка-зоморфины, подобно эндорфинам, эффективно взаимодействуют с опиоидными рецепторами различных типов (Teschemacher вг а1, 1997; Teschemacher, 2003). После их однократного введения (не только центрального, но и системного) наблюда-
ется развитие анальгезии, снижение оборонительной мотивации, улучшение некоторых видов обучения (Дубынин и др., 2004). Это доказывает способность ß-казоморфинов проникать через различные барьеры организма и значимо влиять на функционирование ЦНС. Другие экзорфины (фрагменты гемоглобина, глютена, цитохромов, рибулозобисфосфат карбоксилазы/оксигеназы (РУБИСКО)) изучены меньше, но также способны проявлять нейротропную опиоидоподобную активность (Freeman, Young, 2000; Takahashi et al., 2000; Yang et al., 2001; Lee et al., 2004).
Особый интерес представляет анализ последствий хронического введения экзорфинов в раннем постнатальном периоде, в ходе которого моделируется ситуация получения новорожденными, в первую очередь ß-казоморфинов материнского молока. Проведенные нами ранее исследования показали, что в таком случае наблюдаются отставленные поведенческие изменения, сходные с последствиями однократных инъекций, но сохраняющиеся в течение длительного срока (не менее 1-2 мес.). Так, для гептапептида ß-казоморфина-Т обнаружена способность увеличивать исследовательскую активность животных, снижать их тревожность, ослаблять поведенческие проявления депрессии (тесты "приподнятый крестообразный лабиринт", "принудительное плавание" и др.). Эффекты препарата зависели от сроков введения (1—14, 10-23 либо 21-35-е сут жизни, по 1 мг/кг ежесуточно), что, очевидно, обусловлено динамикой созревания опиоидной системы мозга крыс (Дубынин и др.,
2000). У животных, получавших Р-казоморфин-7, также обнаружено увеличение содержания серо-тонина в коре больших полушарий (Дубынин и др., 1999). Удаление аминокислот с С- и, особенно, N конца приводило к явному ослаблению активности препарата.
Представленная работа посвящена оценке влияния хронического введения Р-казоморфинов, экзорфина С и рубисколина-5 на способность детенышей белых крыс к обучению.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнена на неполовозрелых самцах и самках нелинейных белых крыс - потомках производителей, полученных из питомника Института общей патологии и патологической физиологии РАМН (Москва). Общее число использованных животных - 340 (в среднем 85 особей в каждой из четырех серий экспериментов; число самцов и самок примерно одинаково). Детенышей выращивали в виварии кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. День родов принимали за нулевые сутки их жизни. Животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к воде и корму; каждый выводок размещался в индивидуальной клетке. Использованные в экспериментах Р-казоморфины были синтезированы в Институте молекулярной генетики РАН (ИМГ РАН Москва) под руководством Л.А. Андреевой; в разных сериях были протестированы гептапептид Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile - Р-казоморфин-7 и его укороченный с Оконца аналог гексапептид Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Иe - Р-казоморфин-6. Исследованные нами ру-бисколин-5 (Tyr-Pro-Leu-Asp-Leu) и экзорфин С (Tyr-Pro-Иe-Ser-Leu) были синтезированы во Всероссийском кардиологическом научно-производственном комплексе МЗ РФ (ВКНПК МЗ РФ Москва) под руководством Ж.Д. Беспаловой. (фрагмент РУБИСКО). Введение Р-казоморфинов осуществлялось в дозе 1 мг/кг; экзорфина С и рубисколина-5 - в более высокой дозе 5 мг/кг, поскольку ранее в экспериментах на взрослых животных была обнаружена их менее выраженная физиологическая активность (Дубынин и др., 1998). Она обусловлена относительно малой устойчивостью фрагментов растительных белков к ферментативной деградации (в сравнении с Р-ка-зоморфинами, пептидные цепи которых содержат значительное количество остатков пролина).
Каждый выводок делили на две равные подгруппы - контрольную и опытную. Опытным животным на 1-14-е сут жизни ежесуточно внутри-брюшинно вводили пептиды в водном растворе из расчета 1 мл/кг веса животного; контрольной группе в те же сроки инъецировали эквивалентные объемы растворителя. Выработку условной пищедобывательной реакции на место проводили
в "сложном лабиринте" в возрасте 35-38 сут. Лабиринт представляет собой квадратную камеру (60 х х 60 х 25 см), разделенную пятью прозрачными перегородками на 6 коридоров. В каждой перегородке имеется прямоугольное отверстие. В первые сутки проводилась адаптация крыс к условиям опыта. Для этого их на 15 мин помещали в лабиринт с целью угашения избыточной исследовательской реакции и снижения тревожности. В последующие трое суток проводили собственно выработку навыка, для чего детеныша помещали в лабиринт по 5 раз подряд ежесуточно; длительность каждой посадки не превышала 180 с. В качестве подкрепления использовали хлебные шарики, находившиеся в самом удаленном от экспериментатора коридоре лабиринта. В процессе обучения животное переносили в стартовый (ближайший к экспериментатору) коридор, после чего визуально регистрировали латентный период (ЛП) выхода из него, время реакции (ЛП взятия подкрепления); число выполненных реакций (случаев, когда животное находило подкрепление в течение 180 с пребывания в лабиринте); количество ошибок (отклонений от оптимальной траектории движения, когда крыса после прохода очередного отверстия в перегородке сворачивала в "неверную" сторону). Также подсчитывали количество стоек и актов груминга. В дни опыта животных кормили один раз в сутки непосредственно после эксперимента.
Условный рефлекс пассивного избегания болевого раздражителя (УРПИ) вырабатывали и тестировали у крыс в возрасте 42 и 46 сут. Использовали экспериментальную камеру (50 х 22 х х 35 см), разделенную перегородкой на два неравных отсека: меньший ярко освещался, второй был затемнен. Камеру устанавливали на решетчатый металлический пол, соединенный с электростимулятором. В первые сутки опыта (обучение) животное помещали в освещенный отсек камеры и отмечали ЛП перехода в темноту. После перехода отверстие в перегородке закрывали и на пол подавали прямоугольные импульсы тока напряжением 90 В (общая длительность стимуляции 3 с, длительность одиночного стимула 10 мс, частота следования стимулов 50 Гц). После отключения тока крысу оставляли в затемненном отсеке на 30 с. На 5-е сут (воспроизведение) ее вновь помещали в светлую часть камеры и регистрировали ЛП перехода в затемненный отсек, а также общее время нахождения в темноте в течение 180 с наблюдений.
При обработке результатов использовали стандартный пакет статистических программ Sta-tistica. Вычисляли средние (AM), стандартные отклонения (SD) и ошибки средних (SEM) массивов данных. Для сравнения опытных и контрольных групп применяли параметрический критерий Стьюдента, а также ряд непараметрических критериев.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
При трехсуточном обучении в сложном лабиринте выявлено, что у животных, которым хронически в дозе 1 мг/кг вводили ß-казоморфин-Т, наблюдалось достоверное ускорение выработки пищедобывательного навыка. Показано, что в первые сутки обучения крысы, получавшие пептид, значимо быстрее (р < 0.05 по критерию Стьюдента), чем контрольные, выходили из стартового коридора и совершали меньшее количество ошибок (рис. 1). Во вторые сутки сократился не только средний (по пяти помещениям в лабиринт) ЛП выхода из стартового коридора, но и уменьшилось время реакции. Снижение количества ошибок по сравнению с контролем достигло наибольшего уровня достоверности (р < 0.01 по критерию Стьюдента). На третьи су
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.