ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 4, с. 572-578
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ОТВЕТНАЯ РЕАКЦИЯ ГАМЕТОКЛОНАЛЬНЫХ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ НА ЗАРАЖЕНИЕ N-ШТАММОМ Y-ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ
© 2007 г. Г. Грамматикаки*, А. Авгелис**, А. Соннино***
* Отдел изучения культурных растений, Школа Сельскохозяйственных технологий, Институт технологического образования, Гераклион, Крит, Греция ** Лаборатория растительных вирусов, Национальный фонд сельскохозяйственных исследований,
Крит, Греция
*** Национальное агентство новых технологий, энергии и окружающей среды, Рим, Италия
Поступила в редакцию 14.04.2006 г.
Всего 59 растений Solanum tuberosum было получено путем андрогенеза в культуре пыльников. Сорок семь из них были получены из гамет тетраплоидного растения-донора, 7 - из диплоидного гибридного растения-донора и 5 - из растения-клона, также имеющего андрогенное происхождение. Две трети растений-регенерантов оказались дигаплоидными, некоторые растения были моногаплоидными (5.08% от всех регенерантов) или анеуплоидными (6.78%). Тетраплоидные генотипы дали около трети тетраплоидов. Семьсот двадцать семь растений Rx, полученных из клубней андрогене-тического картофеля, инфицировали N-штаммом Y-вируса картофеля (PVYN), и вызывающим некрозы и выращивали в теплице. Через 50 суток после инокуляции растения проверяли на наличие вируса PVYn с помощью DAS-ELISA. Только у трех растений (0.4%), полученных от генотипа H2-258, наблюдали локальные некротические симптомы заражения (реакция сверхчувствительности). Это позволяет предположить наличие у растений-регенерантов гена Ny и, по-видимому, свидетельствует об эпистатическом характере проявления столь сильной устойчивости по отношению к реакции сверхчувствительности. Иммунитет (наличие Лу-гена) сохранялся после введения в культуру и присутствовал у растений-регенерантов вне зависимости от их плоидности. Растения-регене-ранты проявляли различный тип расщепления по устойчивости в зависимости от плоидности. Это могло быть следствием потери устойчивости во время культивирования, когда имеет место эндоре-дупликация или возможна регенерация из нередуцированных микроспор при реституции второго деления. В любом случае такое расщепление по признаку устойчивости следует учитывать при использовании гаметоклонов в генетических исследованиях.
Solanum tuberosum - гаметоклональная вариабельность - культура пыльников - Y-вирус картофеля - устойчивость к заболеваниям
ВВЕДЕНИЕ
Использование культуры пыльников и получение андрогенных растений картофеля признано потенциально эффективной методикой создания новых сортов, устойчивых к заболеваниям, так как позволяет снизить плоидность растений-регенерантов [1]. Вариабельность среди растений, регенерированных из гамет, так называемая "гаметоклональная вариабельность" [2], может быть вызвана рекомбинациями, происходящими до формирования гамет, или индуцирована самим
Сокращения: PVYN - N-штамм Y-вируса картофеля (от necrotic strain of potato Y-virus); DAS-ELISA - ELISA в виде двойного иммуно-сэндвича.
Адрес для корреспонденции: Grammatikaki G. Department of Crop Science, School of Agricultural Technology, Technological Education Institute, P.O. Box 1939, GR 710 04, Heraklion, Crete, Greece. Fax: +30 2810 317775; e-mail: grammat@steg.teiher.gr
процессом регенерации [3]. Поскольку вариабельность, индуцированная в культуре in vitro, считается нежелательной, селекционеры обычно более заинтересованы в получении растений из пыльников, поскольку в этом случае причиной вариабельности могут быть только процессы рекомбинации. Необычное расщепление среди таких регенерантов может вводить в заблуждение при построении генетических карт [4] и при генетическом анализе.
Во всем мире картофель поражается более чем 40 вирусами [5]. Среди них наиболее опасен Y-вирус картофеля (PVY, от potato Y-virus), который распространяется без персистенции некоторыми видами тлей [6]. Вирус PVY состоит из нитевидных частиц размером 11 х 730 нм и принадлежит к роду Potyvirus, входящему в сем. Potyviridae. Размер ущерба, наносимого этим вирусом урожаю, варьирует в зависимости от штамма вируса, сорта картофеля и времени инфициро-
вания. В зависимости от симптомов, вызываемых вирусом у растений картофеля и у других растений-хозяев, а также от возможности переноса с помощью тлей выделяют четыре группы штаммов этого вируса: PVYO, PVYC, PVYN и PVYNTN. Штамм PVYN, вызывающий некроз сосудов табака, был описан в 1950-х гг. в Европе, куда был завезен из Южной Америки. За последующие десятилетия он стал основной проблемой в картофе-леводческих регионах Европы. У большинства сортов картофеля в то время этот штамм не вызывал ярко выраженных симптомов поражения, поэтому он смог скрытно накопиться в растениях картофеля [7].
Поскольку контроль за распространением тли с помощью инсектицидов оказался неэффективен в борьбе с этим заболеванием, более перспективным может стать выведение сортов картофеля, устойчивых к вирусу PVY [8, 9]. Традиционная селекция на устойчивость базируется на использовании двух доминантных генов, Я¥ и Ыг, обеспечивающих соответственно иммунитет и сверхчувствительность к данному вирусу [10]. Устойчивость к PVY наследуется при выращивании в полевых условиях и сохраняется в культуре пыльников [11].
В данной работе предпринята попытка оценить вариабельность ответных реакций на заражение вирусом PVYN в популяции растений картофеля, регенерированных в культуре пыльников, и установить причины такой вариабельности.
МЕТОДИКА
Культуру пыльников получали, как описано в работе Sopory с соавт. [12]. В качестве растений-доноров использовали три следующих генотипа Solanum tuberosum: тетраплоидный клон H2-258, диплоидный гибрид F1-15, полученный путем скрещивания клонов AH 78/8015.37a х 381320.23, и гомозиготный диплоидный клон AH 78/8015.37a, полученный, в свою очередь, через культуру пыльников.
Эмриоиды переносили на модифицированную среду МС [13] для регенерации, с добавлением 3% сахарозы, 0.3 мг/л зеатинрибозида и разведенного в 10 раз кокосового молока, и культивировали при 24°С, 16-часовом фотопериоде и интенсивности освещения 200 мкмоль/(м2 с). После нескольких недель культивирования побеги размножали и переносили на среду МС с 3%-ной сахарозой. Растения-регенеранты с развитыми побегами и корневой системой высаживали в стерильную почву в сосуды и выращивали в теплице с контролируемой защитой от насекомых. Плоидность растений-регенерантов определяли, подсчитывая
число хромосом в кончиках корней и хлоропла-стах устьичных клеток [14].
Всего было получено 59 гаметоклонов, из них 47 гаметоклонов от генотипа H2-258, 7 гаметоклонов от генотипа F1-15 и 5 гаметоклонов от генотипа AH 78/8015.37a. Когда растения Rx достигали 10 см в высоту, по 10 растений из каждой линии гаметоклонов переносили в полевые условия, на открытый участок в Финикии (недалеко от Ге-раклиона, о. Крит), где наблюдалось постоянное заражение PVY вирусом. Через каждые 15 суток в течение периода вегетации Rj-растения проверяли на наличие симптомов заражения, а за несколько дней перед сбором проб, состоявших из апикальных побегов, ткани проверяли на наличие PVY с помощью метода DAS-ELISA [15], т.е. ELISA в виде двойного иммуно-сэндвича, представляющего собой детекторный иммуноком-плекс из двух слоев разных антител. Для проведения анализа использовали готовый набор реагентов ("Boehringer-Mаnnheim", Германия). Из каждого образца тканей экстрагировали сок, гомогенизируя 1 г ткани в 5 мл буфера для экстракции. Для каждого образца использовали одну ячейку пластин с плоским дном. Поглощение света считывали с помощью MIOS ("Junior Merck", США) при 405 нм через 1 ч после добавления субстрата. Тест повторяли, и результат считали положительным, если среднее поглощение абсорбции для опытного образца превышало среднюю величину для образцов из листьев незараженных растений в три раза.
От R1-растений были собраны 1863 клубней, которые хранили при 8-10°C в течение 4 месяцев. Клубни высаживали в горшки, наполненные стерильной смесью почвы, торфа и песка в соотношении 3 : 2 : 1 и выдерживали в теплице с контролируемой защитой от насекомых при 20 ± 4°C. Всего из клубней было получено 727 растений; из них 574 от 47 гаметоклонов генотипа H2-258, 121 от 7 гаметоклонов генотипа F1-15 и 32 от 5 гаметоклонов генотипа AH 78/8015.37a. В качестве отрицательного контроля использовали 30 и 45 клубней генотипов 381347-7 и (2x-78C115)18, соответственно, обладающих иммунитетом к вирусу PVY. В качестве положительного контроля брали 20 клубней сорта Russet Burbank, восприимчивого к вирусу PVY.
Растения, достигшие 8-10 см, механически инфицировали изолированным местным штаммом PVYN. Для приготовления вирусного инокулята 1 г листьев Nicotiana tabacum, инфицированных PVYN, гомогенизировали в 5 мл фосфатного буфера (0.1 M Na2HPO4 + KH2PO4, pH 7.3). Для инфицирования три листовых пластинки посыпали се-литом и слегка терли ватным тампоном, предварительно смоченным в инокуляте.
Каждую неделю после инфицирования проводили обязательный осмотр растений для выявления местных или системных симптомов поражения. Через 50 суток после инфицирования 727 растений R1 и 32 контрольных растения проверяли на наличие вируса PVYN методом DAS-ELISA, как описано выше.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В целом через культуру пыльников было получено 59 взрослых растений: а именно, 47 от генотипа H2-258, 7 от генотипа F1-15 и 5 от генотипа AH 78/8015.37a. Плоидность регенерантов представлена в табл. 1. Примерно 2/3 (61.6%) расте-ний-регенерантов оказались дигаплоидами. От генотипов Fl-15 и AH 78/8015.37a были получены несколько моногаплоидных растений, а от генотипа H2-258 - треть всех тетраплоидов (34%). Среди растений, регенерированных из пыльников H2-258 и F1-15, были обнаружены несколько анеуплоидов: (3x± и 4x±) и (2x±) соответственно (табл. 1 и 2).
При осмотре Rx-растений, выращенных в полевых условиях, симптомов заражения PVY замечено не было. Вирус не обнаруживался и перед сбором клубней, когда использовали метод ELISA. Следует отметить, что у растений коммерческих сортов Spunta и Kenne
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.