14. Маслова Н.В., Коренман Я.И., Суханов П.Т., Горохов А.А. Применение синергетических смесей гидрофильных растворителей для концентрирования ванилина и этилванилина из водных растворов // Рефераты докл. II Междунар. Форума «Аналитика и аналитики». Воронеж. 2008. Т. 2. С. 580.
15. Маслова Н.В., Коренман Я.И., Суханов П.Т. Экстракционно-фотометрическое определение ванилина // Информ. листок № 35-037-08 / Воронеж. ЦНТИ. 2008. 3 с.
УДК 581.2
ОТВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ РАСТЕНИЙ И КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ТАБАКА НА
ЗАРАЖЕНИЕ
Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus
Ю.В. Омеличкина, аспирант Т.Н. Шафикова, кандидат биологических наук,
старший научный сотрудник А.Л. Алексеенко, младший научный сотрудник Ю.А. Маркова, кандидат биологических наук,
старший научный сотрудник А.Г. Еникеев, кандидат биологических наук,
зав. лабораторией Е.Г. Рихванов, кандидат биологических наук, зав. лабораторией Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН г. Иркутск, Россия
Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (Cms) - грамположительная фитопатогенная бактерия, которая вызывает бактериоз картофеля. Установленно, что инфицирование Cms in vivo, in vitro растений табака индуцирует реакцию сверхчувствительности (СЧ-реакция) в листе- месте контакта организмов и системную приобретенную устойчивость в целом растении. С помощью световой микроскопии продемонстрированно, что при заражение Cms суспензионной культуры клеток табака также наблюдается гибель растительных клеток по типу реакции СЧ, которая, по некоторым признакам, анологична апоптозу в клетках животных.
Ключевые слова: Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, табак, реакция сверхчувствительности, программируемая клеточная гибель, Escherichia coli, системная приобретенная устойчивость.
Сверхчувствительный ответ - это быстрая гибель клеток в центре и вблизи участка инфекции в результате запуска определенной генетической программы, направленной на самоуничтожение растительной клетки, внешне проявляется в виде точечного некроза в месте проникновения патогена [6,7]. Реакция сверхчувствительности у растений, наряду с апоптозом у животных относится к реакциям программируемой клеточной смерти (ПКС) организмов. В ходе развития ПКС в клетке происходит ряд характерных морфологических и биохимических изменений, таких как окислительный взрыв на начальных стадиях, конденсация хроматина с последующей деградацией его на нуклеосомные фрагменты, отставание плазмалеммы по всему периметру от клеточной стенки, набухание органелл и др. [3].
Ранее нами было показано, что инокуляция суспензии вирулентных штаммов Cms в листья табака приводит к быстрой локализованной гибели клеток в месте инокуляции -реакции СЧ [2] Представляло интерес установить параметры вызыванной Cms реакции, для этого в качестве модельной системы была использована суспензионная культура клеток табака. Для проверки специфичности действия Cms использовали суспензионные культуры клеток картофеля и арабидопсиса.
В настоящее время реакцию сверхчувствительности связывают с развитием устойчивости всего растительного организма к последующему заражению фитопатогенами [8]. Интересно было проверить сопровождается ли реакция сверхчувствительности табака, вызываемая Cms, развитием системной устойчивости и распространяется ли данная устойчивость на нетипичных для растений патогенов, которые вызывают заболевания человека. Такой интерес был вызван все чаще встречающимися в литературе данными о способности патогенных для человека и животных микроорганизмов поселяться и размножаться в растительных организмах, а также сохраняться при вегетативном размножении [5].
В работе были использованны in vivo, in vitro растения табака Nicotiana tabacum, которые выращивали при 26°С в почве и на агаризованной среде MS. В экспериментах также использовались суспензионные культуры растительных клеток: табака N. tabacum; картофеля Solanum tuberosum (сорт Жуковский ранний); арабидопсиса Arabidopsis thaliana (Columbia). Суспензионные культуры растительных клеток культивировали при 26 °С на качалке в среде MS.
Инокуляцию листовых пластинок стерильных растений проводили бактериальной суспензией путем укола, путем нанесения капли бактериальной суспензии, а также заражением растений через корневую систему.
Применяли метод совместного культивирования - растительную суспензионную культуру инокулировали бактериальной суспензией, и в течение определенного времени культивировали при 26°С на качалке. Жизнеспособность растительных клеток определяли по восстановлению 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого (ТТХ) до формазана [1]
Для инокуляции растений использовались бактериальные суспензии:
6. суспензия штамма CIC 31 Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, культивируемая при 26°С в жидкой среде C с титром 107 КОЕ/мл [9].
7. суспензия штамма XL-1Blue Escherichia coli, культивируемая при 26°С в МПБ с титром 108 КОЕ/мл.
Для изучения морфологических параметров клеток суспензионной культуры табака при ко-культивировании с Cms использовали методы световой микроскопии.
Образование перекиси водорода клетками табака при инфицировании патогенами определяли с использованием индикатора ксиленола оранжевого [4].
В ходе работы были получены следующие результаты: В суспензионной культуре клеток табака при заражении возбудителем кольцевой гнили картофеля также как и у целого растения быстро развивается гибель клеток (таб.1). Гибель клеток табака, при заражении Cms, регистрировалась уже после 24 часов совместного культивирования.
Таблица 1
Динамика восстановления 2,3,5-трифенилтеразолий хлорида клетками растительных суспензионных культур при совместном культивировании с Cms в течение 24, 48, 72 ч. (OD 490 нм ед/г сырого веса)
Время культивирования, ч Вариант опыта Динамика восстановления 2,3,5-трифенилтеразолий хлорида клетками растительных культур (ОБ 490 нм ед/г сырого веса)
Табак Картофель Арабидопсис
0 контроль 5,01±0,84 10,60±1,39 22,22±1,02
24 контроль 4,88±0,51 7,08±0,51 20,16±1,00
Cms 1,14±0,41 2,75±0,59 19,98±0,84
48 контроль 5,11±0,45 10,74±0,87 23,80±1,71
Cms 0,64±0,34 0,28±0,08 21,59±0,77
72 контроль 3,73±0,65 11,16±0,39 17,59±1,21
Cms 0,08±0,03 0,08±0,03 4,83±1,66
Клетки культуры картофеля, являющегося восприимчивым к данному заболеванию при совместном культивировании с Cms гибли также в первые сутки после инокуляции. Гибель же клеток культуры арабидопсиса была отмечена лишь по истечению 72 часов после инокуляции бактериальной суспензией. Гибель эта предположительно вызывается истощением питательной среды.
При более подробном изучении динамики гибели клеток табака при заражении Cms было обнаружено, что гибель клеток начинается уже через 6-8 часов после совместного культивирования (рис. 1.)
Рис. 1. Динамика выживаемости клеток суспензионной культур клеток табака при ко-
культивировании с Cms
Также при заражении суспензионной культуры клеток табака Cms в гибнущих клетках было обнаружено отставание протопласта от клеточной стенки, что является одним из признаков развития ПКС, одним из видов которой и является реакция СЧ [2].
В первые часы совместного культивирования также был обнаружен резкий скачок содержания внеклеточной перекиси водорода - так называемый окислительный взрыв, также один из признаков развития программируемой гибели (рис. 2.).
Таким образом, при заражении возбудителем кольцевой гнили картофеля суспензионной культуры клеток табака развивается быстрая клеточная гибель, которая сопровождается окислительным взрывом, отставанием протопласта от клеточной стенки. Таким образом, полученные результаты дают основания полагать, что гибель клеток табака при инфицировании Cms присходит по типу программируемой клеточной смерти. Однако данное предположение требует дополнительных исследований.
мин мин мин мин
время совместного культивирования
Рис. 2. Динамика накопления внеклеточной перекиси водорода в культуре клеток табака при
совместном культивировании с Cms
Развитие СПУ сопровождающее реакцию СЧ у растений табака при заражении возудителем кольцевой гнили проверялось с помощью инокуляции стерильных растений и растений табака, зараженных Cms, бактериальной суспензией условно-патогенной энтеробактерией E. coli.
На инокуляцию суспензии E. coli в листья стерильные растения табака не показывали никакой реакции (кроме реакции на механическое повреждение), так же как и на заражение листьев каплей бактериальной суспензии (рис. 3.).
Рис. 3. Реакция растения табака на заражение E. coli;
А- Капля суспензии E. coli на лист; В- Укол суспензии E. coli в жилку листа
При одновременной инокуляции растения бактериальными суспензиями Cms и E. coli, на листе в месте инокуляции E. coli наблюдается поражение лишь от механического повреждения.
При инокуляции суспензией E. coli растений, предварительно зараженных Cms (за 14 суток), в месте инокуляции E. coli наблюдаются точечные некрозы, характерные для СЧ реакции (рис. 4).
Такие некрозы наблюдаются как на растениях зараженных Cms через корни, так и на растениях зараженных путем внесения бактериальной суспензии в лист.
Полученные данные позволяют сделать вывод о способности Cms индуцировать у табака СПУ, которая распространяется не только на фитопатогены, но и на микроорганизмы патогенные для человека.
Кроме представленных результатов в ходе данной работы было обнаружено развитие локальных поражений кончиков корней при заражении растений табака возбудителем кольцевой гнили через корни (рис. 5.)
Тот факт, что некроз локальный и в дальнейшем не распространяется по корню, позволяет провести аналогию между наблюдаемой реакцией на корнях и реакцией сверхчувствительности на листе зараженного растения.
Рис. 4. Реакция растений табака на заражение E. coli; А. Укол стерильного растения суспензией E. coli; В. Укол суспензии E. coli в лист растения зараженного Cms через корни С.Укол суспензии E. coli в лист растения зараженного Cms уколом в лист (серая стрелка - инокуляция Cms, черная стрелка - инокуляция E. coli) D. Укол суспензии E. coli в лист одновременно с уколом Cms
Рис. 5. Растения табака инфицирован
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.