ОНТОГЕНЕЗ, 2011, том 42, № 2, с. 126-132
= МОРФОГЕНЕЗ
УДК 611.013.9
ПАССИВНЫЕ И АКТИВНЫЕ РЕАКЦИИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ НА ДЕЙСТВИЕ ДОЗИРОВАННЫХ МЕХАНИЧЕСКИХ СИЛ1
© 2011 г. А. Н. Мансуров, Л. В. Белоусов
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119992 Москва, ГСП-2, Ленинские горы
E-mail: morphogenesis@yandex.ru Поступила в редакцию 04.06.10 г.
Окончательный вариант получен 23.06.10 г.
С помощью присасывающего манометрического устройства изучали зависимость между деформациями зародышей шпорцевой лягушки на стадиях гаструлы и нейрулы и величинами приложенных сил. Модуль жесткости эмбриональных тканей имел порядок нескольких десятков паскалей и при деформациях от 40 до 120% был им обратно пропорционален. На стадии гаструлы в течение 30 мин после прекращения действия присасывающей силы наблюдали равномерное или нарастающее по скорости втягивание тела зародыша во всасывающий капилляр диаметр которого составлял около половины поперечника зародыша. Длина втянутой части зародыша коррелировала с величиной его деформации за первую минуту. В результате втягивания общая поверхность тела деформированного зародыша возрастала более чем в два раза по сравнению с интактным зародышем. После выталкивания зародыша из капилляра в течение 5 мин его поверхность сокращалась и деформация сглаживалась, что указывает на присутствие в растянутых зародышах упругих сил. Эти данные показывают, что у зародышей стадии гаструлы внешние механические силы не только пассивно деформируют зародыш, но и запускают его активное растяжение, происходящее при нулевой внешней силе и преодолевающее упругое сопротивление тканей. Обсуждаются механизмы активного растяжения и его связь с процессами нормального морфогенеза.
Ключевые слова: морфогенез, механические напряжения, гаструла, модуль Юнга, Xenopus laevis.
ВВЕДЕНИЕ
Одним из важных направлений современной биологии развития становится морфомеханика, изучающая распределение и морфогенетическую роль механических напряжений в клетках и тканях зародыша, а также реакции эмбриональных тканей на механические воздействия. Многочисленные данные, полученные за последние 10—15 лет, указывают на важную, а иногда и решающую роль механических сил и вызываемых ими деформаций для блокирования апоптоза (Huang, Ingber, 2000), нормального протекания морфогенеза (Beloussov etal., 2006), установления паттернов экспрессии генов (Farge, 2003; Kornikova et al., 2010) и определения путей дифференцировки стволовых клеток (Engler et al., 2006). Принципиально важно, что во всех этих случаях наблюдаются активные ответы клеток на внешние механические силы. Одна из моделей связей между внешними механическими силами и активными ответами эмбриональных клеток и тканей предложена в терминах гипотезы гипервосстановления механических напряжений (Beloussov, 2008; Tab-er, 2009).
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект № 05-04-48681).
Дальнейшее развитие морфомеханики требует получения точных количественных данных как о пассивных механических параметрах клеток и тканей (характеризующих их вязко-упругие свойства), так и об их активных ответах. Хотя первые измерения механических сил в ходе развития зародышей были получены около 70 лет тому назад (Waddington, 1939; Moore, 1941; Selman, 1958), планомерные исследования в этом направлении были начаты лишь недавно. Так, на зародышах шпорцевой лягушки (стадии гаструлы-нейрулы) измеряли жесткость эмбриональных тканей (модули Юнга) при сжатии тканей (Zhou et al., 2009) и их растяжении методом присасывания (von Dassow, Davidson, 2009). В обеих работах были получены сходные данные. При сжатии модуль Юнга для гаструл составлял около 20 Ра, а к стадии нейрулы возрастал до 80 Ра. При растяжении тот же показатель для гаструл варьировал в области 10—20 Ра, а к стадии нейрулы возрастал до 20— 140 Ра. Авторы подчеркивают широкую вариабельность этого показателя даже для зародышей одной и той же стадии развития, полученных из одной кладки. Они полагают, что нормальное развитие зародышей при сильно различающихся значениях модуля Юнга свидетельствует о тонкой подстройке активных механохимических реакций с участием цито-скелета к жесткости тканей. Вместе с тем, они не ис-
A E B C F F1 D
}
зародыш
физраствор
масло
инъектор
воздух
Рис. 1. Принципиальная схема установки и положение менисков в ходе измерений. Подробные объяснения в тексте.
следовали зависимости модуля Юнга от величины приложенной силы и/или вызванной ею деформации. В цитированных работах отсутствуют также какие-либо указания об активных реакциях деформированных тканей. Наше исследование было посвящено решению именно двух последних вопросов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Материал. Работу проводили на зародышах шпорцевой лягушки Xenopus laevis Daudin, полученных методом гормональной стимуляции. Измерения проводили на зародышах стадий 12 (средняя га-струла) и 14 (нейрула) по Nieuwkoop, Faber (1956). Зародыши помещали в чашку Петри с агаровым дном, заполненную модифицированным раствором Рингера (MMR). Перед началом измерений с зародышей снимали желточную оболочку.
Описание установки. Был сконструирован прибор, имеющий резервуар с воздухом, связанный на противоположных концах с двумя капиллярами (рис. 1). Один из капилляров (CD) заполнялся маслом. В него вводили иглу инъектора, снабженного винтовой подачей. Противоположный капилляр (АВ) был погружен в раствор MMR. Пространство ВС заполнено воздухом. Диаметр капилляра равнялся 0.6 мм, что составляло примерно половину диаметра зародыша.
Схема измерений механических сил, вызывающих деформацию зародыша. Зародыш плотно прижимали к концу А капилляра, фиксируя его стеклянными иглами, закрепленными в агаровом дне. Это полностью исключало сдвиги или повороты зародыша в ходе опыта. Для каждого опыта устанавливали такие объемы воздуха в отсеке BC, при которых мениск B начнет двигаться либо в сторону инъектора, либо в противоположную сторону. Назовем первый объем полностью разреженным, а второй объем — полностью сжатым воздухом. Для этого с помощью движений иньектора достигали такое давление в резервуаре с воздухом, когда столбик AB начнет удлиняться или укорачиваться соответственно (засасывание раствора в установку или его выпуск). Это необходимо для расчета эффективного давления, воздействующего на эмбрион, так как эмбрион втягивается
только при полностью разреженном воздухе. Затем, во избежание последующих резких рывков мениск С сдвигали влево относительно полностью разреженного воздуха (воздух немного сжимался) на такое малое расстояние, чтобы мениск В не двигался. Затем вращением винта иньектора давление воздуха в отсеке ВС понижали, и когда эмбрион начинал втягиваться в капилляр, понижение прекращали. Зародыш фотографировали с помощью цифровой камеры непосредственно перед началом понижения давления, сразу после остановки инъектора, а также через 1, 5, 10, 20 и 30 мин. В некоторых опытах после этого повышали с помощью иньектора давление в системе, благодаря чему зародыш выталкивался из капилляра. Его фотографировали сразу, через 1 и 6 мин после выхода. В ходе измерений поддерживали внутри установки постоянную температуру с точностью 0.2°С.
Принципы расчетов механических сил. Расчеты проводили на основе уравнения для идеальных газов: P1V1 = P2V2. Для его применения надо знать давление в отсеке с воздухом при полностью разреженном воздухе. Чтобы его рассчитать, измеряли объемы полностью разреженного и полностью сжатого воздуха по фотографиям соответствующих положений менисков на границе вода-воздух и воздух-масло. (На рис. 1 полностью разреженный воздух располагается между менисками В и Б, а полностью сжатый — между менисками Е и С). После стабилизации капиллярных сил давление в системе составило примерно 103 кПа, что соответствует воздуху средней сжатости. Это на 2 кПа выше атмосферного давления. Данная разница возникла за счет капиллярных сил, сжимающих воздух внутри системы. Принимая, что давление воздуха средней сжатости Рср = = (Рсж + Рр)/2, где Рсж и Рр — давление соответственно сжатого и полностью разреженного воздуха, и используя уравнение для идеального газа, получаем, что Pр = (2^.^)/^ + Vс) ~ 102 кПа, что и является стартовым давлением в дальнейших расчетах.
Для расчета действующего на эмбрион отрицательного давления измеряли объем воздуха Ун до начала деформации зародыша (рис. 1, объем между менисками В и Б) и объем воздуха Ук после заданной деформации (объем между менисками В и Б1). В со-
Результаты измерений. (AL/L) — относительные деформации, P — начальное давление, Е — модули Юнга. Подстрочные индексы: 1 — результаты за первую минуту после начала измерений; 10 — за последующие 10 мин; 30 — за все 30 мин измерений; 30—10 — то же за вычетом первых 10 мин; 6 мин out — за 6 мин после выталкивания зародыша из капилляра
№ опытов (AL/L)1 P1 E (AL/L)10 (AL/L)30 (AL/L)6 мин out
1 0.4 86 215 0.21 0.58
2 0.46 76 165 0.24 0.58
3 0.49 76 155 0.07 0.69
4 0.6 66 110 0.55 1.11 0.45
5 0.88 54 61.5 1.42
6 1.18 16 13.5 2.41 2.58
7 1.5 36 24 3.87 1.99 0.8
8 1.85 74 40 4.57 1.99 0.8
9 2.0 138 69 4.0 2.7
10 0.65 115 75 2.78 0.70
11 0.26 44 171 2.07 1.70
12 0.17 27 154 2.26 1.15
13 0.60 62 103 2.09
ответствии с уравнением для идеального газа, отрицательное давление на зародыш Рк = РнУн/Ук, где рн = Рр » 102 кПа.
Механические показатели, измерявшиеся в данной работе. В течение всего периода измерений (в большинстве опытов в течение 30 мин) регистрировали величину действующего на зародыш всасывающего давления в паскалях (Ра) и растяжение введенной в капилляр части зародыша. В ряде опытов по истечении данного времени зародыш выталкивали из капилляра и измеряли изменение его длины в течение 6 мин. За модуль Юнга (модуль жесткости эмбриональных тканей) принимали отношение б = Р : (АХ/Х), где Р — всасывающее давление, регистрируемое сразу после приложения силы, АХ/Х — относительное растяжение введенной в капилляр части зародыша за первую минуту втягивания. Использование для измерения модуля Юнга именно первой минуты действ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.