ОНТОГЕНЕЗ, 2011, том 42, № 6, с. 403-424
БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
УДК 57.017.6; 57.085.23; 57.032;616-006.2.04
ПАТТЕРНЫ ЭКПРЕССИИ ГЕНОВ, СПЕЦИФИЧЕСКИХ ДЛЯ ЛИНИИ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК, В ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТКАХ МЫШИ И ЧЕЛОВЕКА СВЯЗАНЫ С РЕГУЛЯЦИЕЙ БАЗОВОГО И ПЕРВИЧНОГО СТАТУСОВ ПЛЮРИПОТЕНТНОСТИ
© 2011 г. О. Ф. Гордеева, Н. В. Лифанцева, С. В. Хайдуков*
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26 *Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН 117997Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10 E-mail: olgagordeeva@yandex.ru Поступила в редакцию 20.06.11 г.
Окончательный вариант получен 24.06.11 г.
Одним из основных критериев плюрипотентного потенциала клеточных линий является их способность дифференцироваться в линию половых клеток. Линии плюрипотентных стволовых клеток с базовым статусом (ground state) плюрипотентности отличаются от линий с первичным статусом (primed state) способностью обеспечивать развитие полноценных гамет. С целью определения молекулярных механизмов, вовлеченных в регуляцию различных статусов плюрипотентности, мы исследовали паттерны экспрессии генов, участвующих в регуляции развития линии половых клеток, в плюрипотентных стволовых клетках различных типов и клетках эмбриональных тератокарцином мыши и человека. Было установлено, что плюрипотентные стволовые клетки in vitro и в бластоци-сте, а также гоноциты на стадии E13.5 имеют сходные профили экспрессии в отличие от клеток эпи-бласта на стадии E6.5. Количественный ПЦР-анализ в реальном времени показал, что ген Vasa /Ddx4 экспрессируется в эмбриональных стволовых клетках мыши и человека на более низком уровне, чем в бластоцисте и гоноцитах. Кроме того, уровни экспрессии генов Vasa/Ddx4 и E-ras значительно выше в эмбриональных стволовых клетках мыши, чем в эмбриональных стволовых клетках человека. При культивировании дифференцирующихся эмбриональных стволовых клеток и эмбриональных герминативных клеток мыши, а также клеток эмбриональных тератокарцином мыши в системе культивирования, способствующей репрограммированию клеток от первичного (primed) к базовому (ground) статусу плюрипотентности (2i + LIF), мы обнаружили, что только плюрипотентные клетки способны регулировать уровни экспрессии генов Oct4 и Vasa/Ddx4, восстанавливая исходный статус, тогда как в клетках эмбриональных тератокарцином уровни экспрессии генов практически не изменяются. Мы предполагаем, что паттерны экспрессии генов, специфических для линии половых клеток, в частности гена Vasa/Ddx4, могут быть вовлечены в регуляцию базового и первичного статусов плюрипотентности.
Ключевые слова: плюрипотентные клетки, эмбриональные стволовые клетки, тератокарцинома, линия половых клеток, бластоциста, ground state, Vasa, Oct4, E-ras.
Плюрипотентные клетки млекопитающих участвуют в формировании всех типов клеток развивающегося организма и некоторых внезароды-шевых структур. Для исследования механизмов раннего развития млекопитающих широко используются модели in vitro — постоянные клеточные линии плюрипотентных стволовых клеток. Для получения линий плюрипотентных стволовых клеток были разработаны технологические подходы, заключающиеся в культивировании и размножении in vitro плюрипотентных клеток доимплан-тационных эмбрионов или первичных половых клеток разных стадий развития, а также в экспериментальном репрограммировании соматических и половых клеток взрослых организмов до плюрипотентного статуса (Gordeeva, 2010). Различные
линии плюрипотентных стволовых клеток обладают сходными биологическими свойствами, однако клетки линий разных видов, а также линий, полученных с помощью разных методов, проявляют существенные различия в регуляции их статуса, в потенциале к дифференцировке и канцерогенезу (Аёе-^т й а1., 2007; ОкИа й а1., 2007; 8Ыагоуа й а1., 2007; СЫп е! а1., 2010; ОиеПЫег е! а1., 2010).
Одним из основных критериев плюрипотент-ности полученных клеточных линий является их способность дифференцироваться в линию половых клеток. Однако установлено, что не все линии способны обеспечивать развитие полноценных гамет у химерных животных (Иауа8Ы1, 8игаш, 2009). Кроме того, этот критерий не применим для тестирования плюрипотентных стволовых клеток чело-
века. Было показано, что линии эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека отличаются от линий плюрипотентных стволовых клеток мыши, но сходны с линиями стволовых клеток эпибласта мыши, которые получены из более поздней популяции плюрипотентных клеток эмбрионов (Brons et al., 2007; Tesar et al., 2007). Известно, что линии стволовых клеток эпибласта мыши способны дифференцироваться только в соматические клетки, но не способны участвовать в развитии линии половых клеток (Guo et al., 2009). Восстановление потенциала стволовых клеток эпибласта мыши до плюрипотентного статуса, а именно способности формировать линию половых клеток, возможно при усилении экспрессии гена Klf4 или при ингибировании GSK3- и ERK/MAPK-киназ (Guo et al., 2009; Silva et al., 2008; Ying et al., 2008). На основе полученных фактов было предложено различать статусы линий плюрипотентных стволовых клеток. Так, линии ЭСК мыши соответствуют базовому статусу плю-рипотентности (ground state), а линии стволовых клеток эпибласта мыши и ЭСК человека — первичному статусу (primed state) (Nichols, Smith, 2009).
Линии плюрипотентных эмбриональных герминативных клеток (ЭГК) были получены из первичных половых клеток разных стадий развития (от E8.5 до E13.5), которые являются более поздней эмбриональной популяцией коммитирован-ных клеток. Однако в отличие от клеток эпибласта при получении линий ЭГК не требуется дополнительных манипуляций для стабилизации базового статуса плюрипотентности. Эти факты свидетельствуют о большем сходстве генных регуляторных сетей плюрипотентных клеток бластоцисты и первичных половых клеток в отличие от клеток эпибласта. Однако молекулярные механизмы, обеспечивающие конверсию первичных половых клеток в плюрипотентные клетки, практически не исследованы (Resnick et al., 1992; Stewart et al., 1994; Ha-yashi, Surani, 2009).
Стоит отметить, что значительно раньше, чем были получены первые линии плюрипотентных стволовых клеток из бластоцисты, из опухолей семенников и яичников были выделены линии клеток эмбриональных тератокарцином (ЭТК), которые были способны дифференцироваться в эмбриональные клетки различных типов. Эти трансформированные клеточные линии фактически являются первыми линиями "псевдоплюри-потентных" стволовых клеток, подвергшихся аномальному репрограммированию in vivo (Kleinsmith, Pierce, 1964). Кроме того, многочисленные исследования показали, что при адаптации и длительном культивировании in vitro в ЭСК и индуцированных плюрипотентных стволовых клетках происходят генетические и эпигенетические изменения, способствующие их онкогенной трансформации (Mayshar et al., 2010; Laurent et al., 2011). В
некоторых трансформированных линиях ЭСК снижается потенциал к дифференцировке, а нул-липотентные линии ЭТК вообще утрачивают способность спонтанно дифференцироваться (Hovatta et al., 2010). Таким образом, при трансформации плюрипотентных клеток может происходить изменение статуса от плюрипотентного до нуллипо-тентного.
Несмотря на интенсивные исследования плюрипотентных стволовых клеток различного происхождения, вопросы эквивалентности их статуса и потенциала к дифференцировке, сходства механизмов поддержания базового и первичного статуса плюрипотентности, обеспечения баланса пролиферации и дифференцировки, а также способности к онкогенной трансформации остаются открытыми. С целью определения молекулярных механизмов, вовлеченных в регуляцию различных фаз плюрипотентности, мы исследовали паттерны экспрессии генов, участвующих в регуляции развития линии половых клеток, в различных типах плюрипотентных стволовых клеток и клеток ЭТ мыши и человека. Мы изучили также возможность реверсии фенотипа и изменения паттернов генной экспрессии дифференцирующихся ЭСК и ЭГК, а также ЭТК мыши в системе культивирования, способствующей репрограммированию клеток от первичного (primed) к базовому (ground) статусу плюрипотентности
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Культивирование клеток in vitro. В работе были использованы ЭСК мыши линий R1 и CCE, а также ЭГК мыши линий EGC-10 и EG-12.5, любезно предоставленные доктором А. Макларен (А. McLaren, WTCR Institute of Cancer and Developmental Biology, Cambridge, UK). Линии ЭСК человека ESM01, ESM02 и ESM03 любезно предоставлены проф. Г.П. Георгиевым (Институт биологии гена РАН, Москва). ЭТК мыши линий F9 и P19 и ЭТК человека линии PA-1, а также культуры первичных эмбриональных фибробластов человека (ЭФ) получены из Российской коллекции клеточных культур (Банк клеточных культур Института цитологии РАН, Санкт-Петербург). Все плюрипо-тентные клеточные линии мыши и человека, а также линии ЭТК культивировали в среде DMEM, содержащей 1 мМ L-глутамина, 0.1 мМ заменимых аминокислот, 0.1 мМ ß-меркаптоэтанола и 15% телячьей фетальной сыворотки ("HyClone", США). Для линий ЭСК человека вместо сыворотки в среду добавляли 15% заменителя телячьей фетальной сыворотки (Knockout Serum Replacement, "Gibco", США) и 10 нг/мл основного фактора роста фиб-робластов человека ("Invitrogen", США). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки мыши и человека поддерживали на фидере из первичных эмбриональных фибробластов мыши (МЭФ), инактивированных митомицином С
(10 мкг/мл) ("Sigma", США). ЭСК и ЭГК мыши культивировали в бесфидерной системе, добавляя в среду фактор ингибирования лейкемии (leukemia inhibitory factor, LIF) (10 нг/мл) ("Sigma", США).
Для получения эмбриоидных тел, формируемых клетками линий R1, CCE, EGC-10, EG-12.5, F9, P19 и PA-1, использовали метод "висячей капли", описанный ранее (Гордеева и др., 2009). Эм-бриоидные тела (ЭТ) из ЭСК человека получали при механическом разделении колоний недифференцированных клеток. Кластеры клеток культивировали в планшетах для суспензионного культивирования ("Greinerbio", Герм
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.