ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2008, том 421, № 6, с. 842-844
ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 612.821+615.214
ПЕПТИД СЕЛАНК РЕГУЛИРУЕТ ЭКСПРЕССИЮ BDNF В ГИППОКАМПЕ КРЫСЫ IN VIVO ПРИ ИНТРАНАЗАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ
© 2008 г. Л. С. Иноземцева, Е. А. Карпенко, О. В. Долотов, Н. Г. Левицкая, А. А. Каменский, Л. А. Андреева, И. А. Гривенников
Представлено академиком Н.Ф. Мясоедовым 25.12.2007 г. Поступило 11.01.2008 г.
В настоящее время имеются данные о связи стрессогенных воздействий с возникновением таких патологий центральной нервной системы (ЦНС) млекопитающих, как депрессивные и тревожные состояния [1]. При этом патофизиологические эффекты стресса тесно связаны с воздействием на функции гиппокампа [2]. В свою очередь функции гиппокампа, и прежде всего процессы формирования памяти, регулируются нейротрофическим фактором мозга (BDNF, brain derived neurotrophic factor), экспрессия которого в гиппокампе ингибируется стрессом и глюкокор-тикоидами [3]. К настоящему времени показано участие нейротрофинов (главным образом, BDNF) в процессах обучения и формирования энграмм в мозге млекопитающих [4]. BDNF регулирует как кратковременные синаптические функции, так и долговременную потенциацию синапсов за счет связывания со специфическими TrkB-рецептора-ми на постсинаптических нейронах [5, 6]. Показано также увеличение экспрессии мРНК для BDNF в гиппокампе при обучении [7, 8]. Снижение уровня эндогенного BDNF в мозге крысы с помощью введения антител к BDNF или антисмысловых олигонуклеотидов приводит к ухудшению обучения и запоминания [4, 8, 9].
На основе модификации структуры молекулы эндогенного регуляторного тетрапептида тафт-сина (Thr-Lys-Pro-Arg), обладающего широким спектром фармакологической, в том числе психотропной, активности, в Институте молекулярной генетики РАН, в секторе регуляторных пептидов был синтезирован гептапептид пролонгированного действия селанк (Trh-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro). Расширенное фармакологическое изучение селанка, проведенное в ГУ НИИ фармакологии
Институт молекулярной генетики Российской Академии наук, Москва Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
РАМН, позволило выявить у этого соединения уникальный спектр психотропной активности, сочетающий анксиолитический, антидепрессивный и антиамнестический эффекты [10-12]. Исходя из этих данных и в связи с наличием у селанка способности влиять на когнитивные функции мозга (ноотропное действие) и состояние тревожности, нами проводилась проверка гипотезы о стимуляции селанком экспрессии ВБ№ на уровне мРНК и белка в гиппокампе крысы как возможной стадии действия данного пептида на ЦНС.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты на животных. Использовали самцов крыс линии Wistar, массой 200-250 г (Центральный питомник лабораторных животных РАМН). Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище и 12-часовым циклом освещения (включение света в 9:00, выключение в 21:00). Были созданы все условия для минимизации стрессирова-ния животных. Крыс содержали таким образом, чтобы в каждой клетке находились представители контрольных и экспериментальных животных. Селанк в дозах 250 и 500 мкг/кг массы тела крысы вводили интраназально в объеме 100 мкл/кг массы тела животного однократно в промежутке времени от 08:45 до 10:15. Контрольным животным вводили эквивалентный объем дистиллированной воды. В каждой группе было по 4 животных. Через 1, 3, 24 ч после введения препарата крыс забивали декапитацией, и сразу же на льду выделяли исследуемые отделы мозга. Ткань замораживали на сухом льду и хранили при -80°С.
Выделение РНК и полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией. Тотальную РНК из образцов выделяли с помощью фенол-хлороформной экстракции с использованием набора РедвоМ TriFast ("РедЬаЪ", ФРГ), следуя методике и рекомендациям производителя. Полученную РНК трижды промывали 80%-ным этанолом (4°С), растворяли в 100 мкл воды, сво-
ПЕПТИД СЕЛАНК РЕГУЛИРУЕТ ЭКСПРЕССИЮ BDNF
843
бодной от РНКаз, и хранили при -80°С. Содержание РНК измеряли спектрофотометрически, и далее использовали образцы, для которых соотношение оптических плотностей при 260 и 280 нм превышало 1.6.
Обратную транскрипцию проводили, применяя набор фирмы "Силекс" (Россия), согласно протоколу и рекомендациям производителя. Отбирали по 0.25 мкг тотальной РНК и проводили реакцию: 1 ч при 37°С в 50 мкл смеси, содержащей 0.1 мкг случайных гексапраймеров, 200 ед Moloney Murine Leukemia Virus (М-МНУ)-обрат-ной транскриптазы, 150 мкМ смеси дезоксинук-леотидтрифосфатов (дНТФ), 70 мМ трис-HCl (pH 8.3 при 25°С), 16.6 мМ (NH4)2SO4, 7.5 мМ MgCl2. После последующей инкубации 10 мин при 70°С образцы кДНК хранили при -20°С.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием набора реагентов фирмы "Силекс" (Россия) в ДНК-амплификаторе "Тер-цик" ("ДНК-Технология", Россия) в 25 мкл реакционной смеси, состоящей из Taq-буфера, 1.5 мМ смеси дНТФ, 1.25 ед Taq-полимеразы, 1 мкл раствора кДНК и 10 пмоль каждого праймера. Для ПЦР были использованы следующие праймеры ("Синтол", Россия): для гена gapdh [13] 5'-TCCAT-GACAACTTTGGCATTGTGG-3' (прямой), 5'-GT-TGCTGTTGAAGTCGCAGGAGAC-3' (обратный), предполагаемая длина ампликона 376 п.о.; для гена bdnf [14] 5'-CACAGCGGCAGATAAAAAGA-3' (прямой); 5 '-CGGCA ACAAACC ACAAG ATT-3' (обратный); предполагаемая длина ампликона 527 п.о. Условия ПЦР для гена gapdh: старт -5 мин 95°C, 28 циклов, включающих 45 с при 95°C, 45 с при 66°C, 45 с при 72°C; финальная инкубация 10 мин при 72°C. Условия ПЦР для гена bdnf: старт - 5 мин 95°C, 40 циклов, включающих 45 с при 95°C, 45 с при 62°C, 45 с при 72°C; финальная инкубация 10 мин при 72°C.
Условия и число циклов ПЦР, подобранные в предварительных экспериментах, обеспечивали пропорциональность количества продукта амплификации количеству кДНК, внесенной в реакционную смесь.
Продукты реакции разделяли электрофорезом в 2%-ном агарозном геле с УФ-визуализацией с помощью бромистого этидия. Применяя систему BioDocAnalyze ("Biometra", ФРГ), определяли интенсивность свечения продукта, и с помощью программного обеспечения производителя получали значения исходных относительных количеств соответствующих кДНК. Нормализацию уровня экспрессии гена bdnf проводили относительно уровня экспрессии гена gapdh.
Иммуноферментный анализ. Для получения белковых экстрактов ткань взвешивали, помещали в экстракционный буфер (pH 7.7), содержащий 100 мМ трис-HCl, 400 мМ NaCl, 0.4%-ный тритон
Время после введения пептида, ч
Рис. 1. Влияние селанка на экспрессию мРНК для BDNF в гиппокампе крысы при интраназальном введении пептида в дозах 250 и 500 мкг/кг массы тела через 1, 3 и 24 ч после введения. 1 - контроль, 2 -селанк в дозе 250 мкг/кг, 3 - селанк в дозе 500 мкг/кг. * -p < 0.05 (one-way ANOVA).
X-100, 1 мМ PMSF (фенилметилсульфонилфто-рид), 10 мкг/мл апротинина, 10 мкг/мл лейпепти-на, 1 мМ бензамидина, и диссоциировали пипети-рованием. Затем ткань гомогенизировали при 4°С с помощью политрона ("Tissue Tearor Biospec Products", США). Гомогенаты центрифугировали 30 мин при 15000 g (4°С), отбирали надосадочную жидкость и полученные экстракты хранили при -80°С. Концентрацию тотального белка в экстрактах определяли методом Лоури. Определения концентраций BDNF в экстрактах проводили с помощью сэндвич-модификации метода ELISA с использованием набора BDNF Emax Immunoassay System ("Promega", США), следуя методике и рекомендациям производителя с последующей нормализацией по концентрации тотального белка в образце.
Достоверности различий групповых средних оценивали с помощью дисперсионного анализа (one-way ANOVA). Различия считали статистически значимыми при p < 0.05. На рисунках данные представлены как групповые средние ± стандартная ошибка (n = 4).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние селанка на экспрессию мРНК для BDNF в гиппокампе крысы. Было исследовано влияние селанка на экспрессию мРНК для BDNF в гиппокампе крысы при интраназальном введении пептида в дозах 250 и 500 мкг/кг массы тела животного через 1, 3 и 24 ч после введения (рис. 1). Как видно из рисунка, селанк достоверно в 1.52.0 раза по сравнению с контролем увеличивал
844
ИНОЗЕМЦЕВА и др.
Уровень BDNF, % от контр.
150 125 100 75 50 25 0
Ш И2 ш
*** i
3 24
Время после введения пептида, ч
Рис. 2. Влияние селанка на уровень BDNF в гиппокам-пе крысы при интраназальном введении пептида в дозах 250 и 500 мкг/кг массы тела через 3 и 24 ч после введения. 1 - контроль, 2 - селанк в дозе 250 мкг/кг, 3 - селанк в дозе 500 мкг/кг. * -p < 0.05; ** -p < 0.01; *** -p < 0.001 (one-way ANOVA).
уровень мРНК для ВВ№ в гиппокампе через 3 ч после введения в дозах 250 и 500 мкг/кг массы тела животного. Достоверных изменений в уровнях мРНК для этого нейротрофического фактора через 1 и 24 ч после введения пептида не было отмечено.
Влияние селанка на уровень белка BDNF в гиппокампе крысы. В следующей части настоящей работы исследовано влияние интраназального введения селанка на уровень белкового продукта гена Ьён/. В результате обнаружено статистически достоверное увеличение уровня ВБ№ на 30% по сравнению с контролем в гиппокампе крысы через 24 ч после введения пептида в дозах 250 и 500 мкг/кг массы тела (рис. 2). С другой стороны, через 3 ч после введения селанка в дозе 500 мкг/кг массы тела отмечено достоверное уменьшение уровня ВБ№ в гиппокампе примерно на 40%, причем для этой же временной точки для дозы 250 мкг/кг массы тела достоверного изменения уровня ВОда в гиппокампе обнаружено не было. Повышение уровней как мРНК, так и белка ВОда свидетельствует о том, что под действием селанка происходит стимуляция экспрессии этого нейротрофического фактора именно в клетках гиппокампа, а не его транспорт по аксонам из других отделов мозга. Полученные результаты указывают на то, что пептид селанк, обладающий анксиолитическими и ноотропными свойствами, способен регулировать уровень ВВ№ в гиппо-
кампе крысы. В настоящее время не известны соединения с анксиолитической активностью, регулирующие экспрессию BDNF в мозге млекопитающих. Однако среди соединений, обладающих ноотропной активностью, так
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.