ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2010, том 431, № 5, с. 703-706
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.15
ПЕПТИДЫ, ПРОИЗВОДНЫЕ ТРЕТЬЕЙ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОИ ПЕТЛИ СЕРОТОНИНОВОГО РЕЦЕПТОРА ШЕСТОГО ТИПА, КАК РЕГУЛЯТОРЫ ЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ К СЕРОТОНИНУ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНОЙ СИГНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ
© 2010 г. А. О. Шпаков, И. И. Тарасенко, Е. А. Шпакова
Представлено академиком В.Л. Свидерским 28.07.2009 г. Поступило 28.07.2009 г.
Одной из актуальных проблем современной биохимии и молекулярной эндокринологии является поиск высокоселективных регуляторов гормональных сигнальных систем. Многие гормоны связываются с несколькими типами рецепторов, которые сопряжены с различными гетеро-тримерными ГТФ-связывающими белками (О-белками), следствием чего является активация сразу нескольких сигнальных каскадов, в том числе антагонистичных, что ведет к побочным эффектам гормональной терапии. В полной мере это относится к серотониновым рецепторам (СР), которых у млекопитающих насчитывается 18 подтипов и через которые осуществляется регуляция множества сигнальных путей. Так, активация серотонином серотониновых рецепторов четвертого, шестого и седьмого типов через посредство О-белков стимулирующего типа (О5) приводит к стимуляции фермента аденилатцик-лазы (АЦ), в то время как активация гормоном СР первого типа через посредство О-белков ингиби-рующего типа (О() вызывает ингибирование АЦ. Несмотря на то, что в настоящее время разработано значительное число селективных агонистов и антагонистов СР, большинство из них действует на несколько типов рецепторов, нарушает про-цессинг рецепторных молекул в клетке. Вследствие этого значительный интерес представляют негормональные регуляторы СР, действующие на пострецепторных этапах передачи серотониново-го сигнала. Наиболее перспективными из них являются синтетические пептиды, которые соответствуют по первичной структуре участкам ци-топлазматических петель (ЦП) рецепторов, функционально важным для связывания и активации О-белков [1, 2].
Цель работы состояла в синтезе пептидов, производных С-концевого участка 258—268 третьей
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова
Российской Академии наук, Санкт-Петербург
ЦП СР шестого типа, который стимулирующим способом сопряжен с АЦ, и изучению их влияния на чувствительную к серотонину аденилатцик-лазную сигнальную систему в мозге крыс. Выбор С-концевого участка третьей ЦП рецептора обусловлен тем, что согласно данным, полученных нами и другими авторами, этот участок в большинстве рецепторов серпантинного типа, сопряженных с G^-белками, наиболее важен для их взаимодействия с G^-белком и передачи гормонального сигнала к АЦ [2—6]. Нами впервые были синтезированы три пептида: КН8ЯКАЬКАБЬ258-268КА-амид (I), соответствующий С-концевому участку третьей ЦП СР шестого типа; его пальмитоилированный аналог КН S RKALKAS L258-268 К( Palm) А-амид (II); димер (KHSRKALKASL258-268KG)2KA (III), в котором два фрагмента 258-268 соединены через посредство амидных связей с а- и s-аминогруп-пами лизина. Выбор СР шестого типа связан с тем, что этот рецептор, локализованный преимущественно в центральной нервной системе, играет определяющую роль в контроле процессов запоминания и обучения, а нарушение его функций приводит к развитию тяжелых психических заболеваний, эпилепсии и ожирению [7].
Фракции плазматических мембран из ткани мозга самцов крыс линии Вистар выделяли по методу [8]. Для получения каждой фракции брали 9-12 крыс. Активность АЦ (время инкубации 10 мин) и уровень ГТФ-связывания G-белков (время инкубации 40 мин) определяли, как описано ранее [9, 10]. Для определения активности АЦ применяли [а-32Р]АТФ, 4 Ки/ммоль ("Изотоп", Россия), для определения ГТФ-связывания использовали ß,y-имидо[8-3H]-гуанозин-5'-три-фосфат ([8-3H]GppNHp), 5 Ки/ммоль ("Amer-sham", Англия). Специфическое ГТФ-связывание рассчитывали как разность между связыванием меченого [8-3H]GppNHp в пробе в отсутствие ГТФ и таковым в присутствии 10 мМ ГТФ. Перед определением активности АЦ и уровня ГТФ-свя-зывания фракции мембран инкубировали с пептидами при 4°C в течение 10 мин.
704
ШПАКОВ и др.
Активность АЦ, %
ГТФ-связывание, %
Рис. 1. Влияние СР6-пептидов на базальную активность АЦ (а) и базальный уровень ГТФ-связывания (б) во фракциях плазматических мембран мозга крыс. 1 — пептид I; 2 — пептид II; 3 — пептид III. Базальная активность АЦ, которая составила 58.3 ± 2.9 пмоль цАМФ на 1 мг мембранного белка за 1 мин, и базальный уровень ГТФ-связывания, который составил 5.31 ± 0.45 пмоль [8-3H]GppNHp ' на 1 мг мембранного белка, приняты за 100%.
Все пептиды были получены в соответствии со стандартным твердофазным методом синтеза пептидов на полимерном носителе — я-метил-бензгидриламинной смоле со средней емкостью 0.55 ммоль/г (0.25 ммоль) с помощью полуавтоматического синтезатора NPS-4000 ("Neosystem Laboratoires", Франция). Для введения в пептид II остатка пальмитиновой кислоты синтезировали пальмитоилированный по 8-аминогруппе лизин, осуществляя конденсацию пентафторфенилово-го эфира пальмитиновой кислоты с N-^рет.-бутил оксикарбонил)лизином с помощью диизо-пропилкарбодиимида в присутствии триэтилами-на. Структура пептидов была подтверждена
данными масс-спектрометрии и аминокислотного анализа.
Все синтезированные пептиды, производные С-концевого участка третьей ЦП СР шестого типа (СР6-пептиды), дозозависимым способом стимулировали базальную активность АЦ и базальный уровень ГТФ-связывания во фракциях плазматических мембран мозга крыс (рис. 1). Наиболее эффективным среди них был пептид II, модифицированный пальмитатом. Димерный пептид III существенно уступал немодифициро-ванному пептиду I по способности стимулировать АЦ, но был сопоставимым с ним по способности стимулировать ГТФ-связывание. Значения EC50 для стимулирующих АЦ-эффектов пептидов I, II и III составили 1.8, 0.95 и 1.5 мкмоль, для стимулирующих ГТФ-связывание эффектов — 3.9, 1.6 и 3.6 мкмоль соответственно.
Таким образом, СР6-пептиды в отсутствие гормона способны запускать цАМФ-зависимый сигнальный каскад, мимикрируя действие активированного гормоном СР. Ранее нами и другими авторами было обнаружено, что пептиды, производные С-концевых участков других рецепторов серпантинного типа, также способны активировать сигнальные каскады, осуществляя свои эффекты на пострецепторных этапах передачи гормонального сигнала [2—6]. При этом, как и в случае СР6-пепти-дов, наиболее эффективными были пептиды, модифицированные гидрофобными радикалами, которые лучше проникают сквозь мембрану и концентрируются вблизи белков, мишеней их действия
[4, 6].
На следующем этапе исследования с целью установления селективности действия СР6-пеп-тидов были использованы селективные агонисты и антагонисты СР.
Показано, что серотонин, агонист СР шестого типа 2-этил-5-метокси-К,К-диметилтриптамин (EMDT), агонист СР седьмого типа 5-карбоксиа-мидотриптамин и агонист СР 1А-подтипа и седьмого типа 8-гидрокси-2-(ди-я-пропиламино)тетралин (8-OH-DPAT) в концентрациях 10-6 М стимулируют АЦ на 296, 169, 119 и 62%, и ГТФ-связывание на 139, 66, 52 и 56% соответственно. В присутствии СР6-пептидов (10-5 М) стимулирующие АЦ и ГТФ-связывание эффекты серотонина снижались и составляли 56—63 (для АЦ) и 73—77% (для ГТФ-связывания) от таковых в контроле (рис. 2). Стимулирующие АЦ и ГТФ-связывание эффекты EMDT — селективного агониста СР шестого типа, в значительной степени блокировались в присутствии СР6-пептидов и составляли 14—30 и 9— 17% от таковых в контроле. Наиболее эффективными ингибиторами стимулирующих эффектов серотонина и EMDT были пептиды II и III. Стимулирующие эффекты 5-карбоксиамидотрипта-мина и 8-OH-DPAT, которые активируют СР, отличные от СР шестого типа, в присутствии СР6-
ПЕПТИДЫ, ПРОИЗВОДНЫЕ ТРЕТЬЕЙ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОИ ПЕТЛИ
705
Стимулирующий АЦ-эффект, %
100 -
80
60 -
40 -
20
0
I
II
III
Стимулирующий ГТФ-свзяывание эффект, %
(б)
100'
80 60 40 20 0
II
III
Рис. 2. Ингибирующее влияние СР6-пептидов на стимуляцию АЦ (а) и ГТФ-связывания (б) серотонином и селективными агонистами СР (10-6 М). Эффекты агонистов в отсутствие СР6-пептидов приняты за
100%. I, II, III - пептиды I, II, III (10-5 М) соответственно. 1 - серотонин; 2 - EMDT; 3 - 5-карбокси-амидотриптамин; 4 - 8-OH-DPAT.
Стимулирующий АЦ эффект, % 120
100
80
60
40
20
0 I II
Стимулирующий ГТФ-связывание эффект, % 120
(б)
100|- "
L
801 60 40 20
0
I II
Рис. 3. Влияние СР6-пептидов на стимулирующие АЦ (а) и ГТФ-связывание (б) эффекты серотонина (10-6 М) в присутствии антагонистов СР. Эффект гормона в отсутствие антагонистов и СРб-пептидов принят за 100%. I — без пептида; II — в присутствии пептида II (10-5 М). 1 — без антагониста; 2 — 8В-271046, 10-6 М; 3 — метиотепин, 10-6 М; 4 — циано-пиндолол, 10—6 М; 5 - кетансерин, 10—6 М. Звездочками отмечены значения эффектов серотонина в присутствии СР6-пептидов, достоверно отличающиеся от значений в их отсутствие прир < 0.05.
I
пептидов менялись незначительно (рис. 2). СР6-пептиды также не влияли на стимуляцию ГТФ-связывания 5-метокси-М,М-диметилтриптами-ном, который является агонистом СР первого и второго типов (данные не представлены).
Селективный антагонист СР шестого типа 5-хлоро-М-(4-метокси-3-(пиперазин-1-ил)фенил)-3-метилбензо[Ь]тиофен-2-сульфонамид (БВ-271046) и антагонист СР первого, шестого и седьмого типов метиотепин (10—6 М) снижали стимулирующие АЦ-эффекты серотонина до 54 и 13% и стимулирующие ГТФ-связывание эффекты гормона — до 76 и 29% от таковых в отсутствие антагонистов (рис. 3). Цианопиндолол — антагонист СР 1А- и 1В-подтипов, и кетансерин — антаго-
нист СР второго типа практически не влияли на АЦ-эффект серотонина, но заметно снижали стимуляцию им ГТФ-связывания — до 70 и 88% соответственно. Пальмитоилированный пептид II ин-гибировал как стимулирующие эффекты серото-нина в отсутствие антагонистов, так и эффекты гормона, которые наблюдались в присутствии цианопиндолола и кетансерина, практически не действующих на СР шестого типа (рис. 3). В то же время ингибирующее влияние пептида не выявлялось в отношении эффек
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.