ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2011, том 437, № 1, с. 128-131
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, ^^^^^^^^^^ МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.17
ПЕПТИДЫ, СООТВЕТСТВУЮЩИЕ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИМ УЧАСТКАМ СОМАТОСТАТИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ, С АКТИВНОСТЬЮ АГОНИСТОВ И АНТАГОНИСТОВ © 2011 г. Е. А. Шпакова, А. О. Шпаков
Представлено академиком В.Л. Свидерским 01.07.2010 г. Поступило 01.07.2010 г.
Нейрогормон соматостатин, широко представленный в ЦНС и периферических тканях человека и животных, специфически связывается с пятью типами соматостатиновых рецепторов (Сом1Р—Сом5Р), которые семь раз пронизывают плазматическую мембрану и сопряжены с гетеро-тримерными О-белками. Через посредство СомР соматостатин регулирует активность внутриклеточных сигнальных каскадов, что в конечном итоге и определяет его биологическую активность. Соматостатин контролирует секрецию множества гормонов и ростовых факторов, влияет на передачу гормональных сигналов в нервной системе, регулирует рост и дифференцирование клеток [1]. Многие свои эффекты он реализует через чувствительную к нему аденилатциклазную сигнальную систему (АЦСС), включающую наряду с СомР О-белок ингибирующего типа (О() и фермент аденилатциклазу (АЦ), катализирующий образование вторичного посредника цАМФ. Предполагается, что в СомР за взаимодействие с О(-белками, как и в большинстве других рецепторов серпантинного типа, отвечают проксимальные к мембране участки третьей цитоплазматиче-ской петли, в том числе ее С-концевой участок (С-ЦП-3) [2, 3], который является цитоплазмати-ческим продолжением шестого трансмембранного домена и обычно обогащен положительно заряженными аминокислотными остатками [4].
Получены многочисленные данные в пользу того, что синтетические пептиды, соответствующие по первичной структуре С-ЦП-3 рецепторов, легко проникают в клетку через плазматическую мембрану и в отсутствие гормона меняют активность сопряженных с О-белками сигнальных систем [5]. Эти пептиды влияют на передачу гормонального сигнала через гомологичные им рецепторы, причем в большинстве случаев они
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова
Российской Академии наук, Санкт-Петербург
выступают в роли внутриклеточных антагонистов, снижая вызываемые гормоном биологические эффекты. Имеется лишь одна работа, авторы которой получили пептид, производный ЦП-3 рецептора, являющийся внутриклеточным аго-нистом, который усиливал действие гормона на клетку [6]. В связи с этим поиск внутриклеточных пептидных регуляторов с активностью агонистов, способных с высокой селективностью повышать чувствительность клеток к регуляторному действию гормонов, представляет собой одну из актуальных задач молекулярной эндокринологии и фармакологии.
Цель работы состояла в синтезе пептидов, соответствующих С-ЦП-3 СомхР и Сом2Р, и изучении их влияния на базальную и стимулированную соматостатином и селективными агонистами СомР активность АЦСС в тканях мозга и взятом для сравнения миокарде крыс. Выбор Сом^ и Сом2Р связан с ключевой ролью этих рецепторов в регуляции нервной, пищеварительной и репродуктивной систем, а также с тем, что нарушение функционирования Сом^ и Сом2Р является одной из причин развития онкологических заболеваний.
Пептиды ЬКАО^^дККЯ8ЕЯК1ТЬ255-271-амид и 1ЯУО88КККК8ЕККУТЯ240-256-амид, соответствующие С-ЦП-3 Сом1Р и Сом2Р крысы, синтезировали с помощью стандартного твердофазного метода на пара-метилбензгидриламинной смоле (емкость 0.55 ммоль/г, 0.25 ммоль) с помощью синтезатора NPS-4000 ("Neosystem Laboratoires", Франция). Структура пептидов была подтверждена данными аминокислотного и масс-спектро-метрического анализов. В работе использовали соматостатин-14 ("Sigma", США), Сом1Р-аго-нист CH-275 ("Neosystem", Франция) и Сом2Р-агонист октреотид ("Novartis Pharma", Швейцария). Для определения активности АЦ использовали [а-32Р]АТФ (30 Ки/ммоль) производства ОАО "Институт реакторных материалов" (Россия), для определения ГТФ-связывания G-белков — ß,y-
ПЕПТИДЫ
129
Стимулирующий эффект форсколина на активность АЦ, %
ГТФ-связывание, %
5 4
-^[пептид], М
Рис. 1. Ингибирующее влияние пептидов 255— 269 Сом1Р и 240—254 Сом2Р на стимулированную форсколином активность АЦ в синаптосомальных мембранах мозга крыс. Стимулирующий АЦ эффект 10-5 М форсколина в отсутствие пептидов принят за 100%.
160
120
80
40
* *
□ 1 □ 2
Ш4
Ш5
имидо[8-3Н]-гуанозин-5'-трифосфат ([8-3Н]Орр-МНр) 5 Ки/мМ ("ЛшегеИаш", Англия).
Выделение фракций плазматических мембран из мозга и миокарда крыс, определение в них активности АЦ и ГТФ-связывания О-белков проводили, как описано ранее [7, 8]. Активность АЦ оценивали по количеству цАмФ, который получался в результате ферментативной реакции, и выражали в пмоль цАМФ/мин на 1 мг мембранного белка. Специфическое ГТФ-связывание, которое определяли как разность между связыванием меченого [8-3Н]ОррМНр в пробе в отсутствие и в присутствии 10 мМ ГТФ, выражали в пмоль [8-3Н]ОррМНр на 1 мг мембранного белка. Преинкубацию мембран с пептидами вели в течение 10 мин при 4°С.
Статистический анализ полученных данных проводили с использованием компьютерной программы ЛМОУЛ. Данные представлены в виде М ± 8.Б.М. из трех или четырех независимых экспериментов. Различия между пробами оценивали как достоверные при Р < 0.05.
Показано, что форсколин (10-5 М) на 487% повышал базальную активность АЦ во фракциях си-наптосомальных мембран мозга крыс, которая в отсутствие форсколина составляла 18.4 ± 1.3 пмоль цАМФ/мин на 1 мг мембранного белка. Сомато-статин-14, Сом1Р-агонист СН-275 и Сом2Р-аго-нист октреотид (10-6 М) снижали стимулированную форсколином активность АЦ на 53, 27 и 35% и повышали базальный уровень ГТФ-связывания О-белков на 136, 61 и 80% соответственно. В миокарде стимулирующий АЦ эффект форсколина
Рис. 2. Влияние пептидов 255—269 Сом^ и 240— 254 Сом2Р на базальный уровень ГТФ-связывания О-белков в мозге (а) и миокарде (б) крыс. 1 — без пептида; 2 — пептид 255—269, 10-5 М; 3 — пептид 255— 269, 10-4 М; 4 - пептид 240-254, 10-5 М; 5 - пептид 240-254, 10-4 М. Базальный уровень ГТФ-связыва-ния, который в мозге и миокарде составил соответственно 4.4 ± 0.2 и 3.6 ± 0.3 пмоль [8-3Н]ОррМНр на 1 мг мембранного белка, принят за 100%. *Р < 0.05.
был выше, чем в мозге (579%). В то же время регу-ляторные эффекты соматостатина-14 и октреоти-да были существенно ниже, а действие СН-275 практически не выявлялось. Так, в миокарде со-матостатин и октреотид ингибировали АЦ на 23 и 11% и повышали уровень ГТФ-связывания на 43 и 14% соответственно. Эти результаты свидетельствуют о том, что соматостатин и агонисты Сом1Р и Сом2Р с высокой эффективностью регулируют активность сопряженной с О(-белками АЦСС в мозге, для которого характерна высокая плотность Сом1Р и Сом2Р [1, 9], но сравнительно слабо влияют на АЦСС в миокарде, где выявляется экспрессия только Сом5Р [10].
Пептид 255-269 Сом1Р отчетливо снижал стимулированную форсколином активность АЦ (рис. 1) и повышал базальный уровень ГТФ-свя-зывания в мозге крыс (рис. 2). Пептид 240-254 Сом2Р в этом отношении был менее активным. В концентрации 10-4 М он снижал активность АЦ только на 19%, в то время как пептид 255-269 Сом1Р - на 31%. В миокарде оба пептида практически не влияли на активность АЦ, а их стимулирующий эффект на ГТФ-связывание не превышал 17%. Таким образом, пептиды, производные С-ЦП-3 Сом1Р и Сом2Р, стимулируют ГТФ-свя-зывание О-белков и ингибируют активность АЦ в тканях мозга, но слабо влияют на АЦСС в миокарде, где отсутствуют гомологичные им рецепто-
0
130
ШПАКОВА, ШПАКОВ
Ингибируюущий эффект на активность АЦ, %
А
200 160 120 80 40
□ 1 □ 2 □ 3
0
а б в
Стимулирующий эффект на ГТФ-связывание, %
Б
160
120
80
40
Рис. 3. Влияние пептидов на ингибирующий АЦ эффект соматостатина и агонистов СомР (А) и на стимуляцию ими ГТФ-связывания (Б). а — соматостатин; б — CH-275; в — октреотид. 1 — без пептида; 2 — пептид 255-269, 10-4 M; 3 - пептид 240-254, 10-4 M. Ин-гибирующие АЦ эффекты соматостатина и агонистов СомР (10-6 M) и их стимулирующие эффекты на ГТФ-связывание в отсутствие пептидов приняты за 100%. *P < 0.05.
ры. Ранее нами и другими авторами было показано, что пептиды, производные серотонинового рецептора 1В-подтипа, 8- и ц-опиоидных рецепторов и рецептора ангиотензина II, которые так же как и СомР сопряжены с О(-белками, в отсутствие гормона активируют Огбелки и ингибиру-ют активность АЦ, однако тканеспецифичность их действия не была исследована [8, 11, 12].
Преинкубация фракций синаптосомальных мембран мозга крыс с пептидом 255—269, производным Сом1Р, приводила к ослаблению ингиби-рующих эффектов соматостатина и Сом1Р-агони-ста СН-275 на стимулированную форсколином
активность АЦ, а также к снижению их стимулирующих эффектов на ГТФ-связывание, причем регуляторные эффекты СН-275 подавлялись почти полностью (рис. 3). Следует отметить, что эффекты Сом2Р-агониста октреотида на АЦСС при этом менялись незначительно. Полученные результаты указывают на то, что пептид 255—269 Сом1Р селективно ингибирует передачу гормонального сигнала через гомологичный ему полноразмерный Сом1Р, являясь антагонистом этого рецептора, но практически не влияет на активацию других типов СомР. Ранее мы показали, что пептиды, производные С-ЦП-3 релаксинового рецептора RXFP1 и серотониновых рецепторов типов 1В и 6, также обладают активностью внутриклеточных антагонистов по отношению к гомологичным им рецепторам [8, 13]. Согласно представлениям, развиваемым А. КиИори1о8 и соавторами, в основе антагонистического действия пептидов лежит их способность с высокой специфичностью взаимодействовать с комплементарными участками рецептора, менять их конформа-цию и нарушать сопряжение рецептора с О-бел-ками [6, 15].
Пептид 240—254 Сом2Р в значительной степени усиливал ингибирующий АЦ эффект Сом1Р-агониста СН-275 и в меньшей степени соответствующие эффекты соматостатина и октреотида, а также повышал стимулирующий эффект СН-275 на ГТФ-связывание во фракциях синаптосомаль-ных мембран мозга крыс (рис. 3). Эти данные свидетельствуют о том, что пептид 240—254 Сом2Р усиливает активацию Сом1Р соматостати
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.