ПОЧВОВЕДЕНИЕ, 2009, № 11, с. 1354-1361
БИОЛОГИЯ ПОЧВ
УДК 579.64:631.46
ПЕРЕМЕЩЕНИЕ БАКТЕРИЙ ИЗ ЭКСКРЕМЕНТОВ ЖИВОТНЫХ В ПОЧВУ И СОПРЯЖЕННЫЕ С НЕЙ МЕСТООБИТАНИЯ*
© 2009 г. Ä. Ä. Куприянов1, Н. Н. Куненкова1, Ä. X. К. Ван Бругген2, Ä. М. Семенов1
биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы
e-mail: aakupriyanov@mail.ru 2Группа органического земледелия Университета Вагенингена, 6709 PG Вагенинген, Нидерланды
Поступила в редакцию 12.02.2009 г.
Исследована популяционная динамика Salmonella enterica var. Typhimurium MAE 110 gfp, Escherichia coli O157:H7 gfp и Pseudomonas fluorescens 32 gfp при интродукции в экскременты крупного рогатого скота (ЭКРС) и при последующих перемещениях в почву, на растения кресс-салата (Lepidium sativum L.) и через желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) виноградных улиток (Helix pomatia L.). Выживание в ЭКРС и почве исследовали при циклически меняющейся (день-ночь, 25-15°С) и постоянной (18°C) температуре. Циклически меняющаяся температура негативно влияла на выживание E. coli O157:H7 gfp и P. fluorescens, но не на S. enterica var. Typhimurium. Все бактерии и особенно аналоги энтеропатогенов показали высокую выживаемость в ЭКРС, почве, на растениях и в экскрементах виноградных улиток, хотя и при постепенном уменьшении численности. На растениях кресс-салата, выращенных в смеси ЭКРС-почва, наблюдали прирост численности интродуцентов.
ВВЕДЕНИЕ
Исследование путей распространения микроорганизмов в природных средах: в почве, компостах, растительных остатках, на растениях, а также определение риска попадания патогенных микроорганизмов в организм человека и животных, остается крайне актуальной задачей [1, 3]. ЭКРС в некомпостированном виде нередко вносят в почву в качестве удобрений. Если эти экскременты содержали патогенные микроорганизмы, такие как Salmonella spp., Escherichia coli 0157:H7 и некоторые другие, возникает опасность контаминации не только почвы и воды, но и растений, в частности овощной продукции, выращиваемой в такой почве [7, 9, 15, 25]. Судьбу микроорганизмов, попадающих в окружающую среду с экскрементами животных, определяет множество факторов: влажность, температура, наличие питательных веществ, состав и активность аборигенного микробного сообщества и другие [11, 12, 14, 25].
В естественных условиях в почве температура циклически изменяется, в первую очередь, при смене дня и ночи. Влияние суточных колебаний температуры при хранении навоза, в случае если не происходит саморазогревания, заметно только в поверхностном слое. Подобное возможно в навозе при пастбищном содержании скота, когда объем экскрементов в каждом конкретном месте невелик. В этих условиях влияние суточных колебаний температуры на выживание бактерий в
* Исследования поддержаны NWO - RFBR (Dutch - Russia) collaborative grants (Dossier numbers 047.014.001 and 047.0147.011) for A.H.C. van Bruggen and A.M. Semenov.
экскрементах, в почве, на растениях, в целом, должно быть существенным. Следовательно, важны знания закономерностей выживания бактерий, и в частности энтеробактерий, не только в условиях стабильной температуры, чему посвящено много исследований [7, 14, 25], но и при циклически изменяющейся температуре, что имеет место в природе, а такие исследования в условиях, близких к естественным, еще не проводились [16, 20, 23].
Традиционным методическим приемом исследования выживания микроорганизмов в естественных субстратах является их интродукция и прослеживание популяционной динамики выживания в конкретном субстрате. Динамика популяций сапротрофных микроорганизмов при их интродукции в одном субстрате исследованы хорошо [2, 8]. Исследования выживания микроорганизмов при последовательном перемещении их во второй или в третий субстрат довольно редки [7, 22]. Интродукция микроорганизмов в достаточно высоких дозах позволяет выявить произойдет ли стабилизация численности в первом, а тем более в последующих субстратах, или для них характерна только одна закономерность - более или менее быстрое, но неизменное уменьшение численности и полное исчезновение. Последнее в природе маловероятно, так как в этом случае энтеропатогены давно бы исчезли из экосистем.
Целью настоящей работы было исследование популяционной динамики сапротрофной и двух энтеропатогенных бактерий в ЭКРС при циклически меняющейся и постоянной температуре и
при попадании их в почву с ЭКРС, а также возможности появления их на растениях и в экскрементах после прохождения через ЖКТ беспозвоночных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Микроорганизмы и среды для их выращивания и выявления. Объектами исследований были генетически маркированные бактерии, способные синтезировать зеленый флуоресцирующий белок (GFP). Salmonella enterica var. Typhimurium MAE 110 gfp (в дальнейшем для краткости - S. Typhimurium gfp) получена от д-ра Юты Ремлинг (микробиологический центр, Каролевский институт, Стокгольм, Швеция), Escherichia coli O157:H7 gfp получена из лаборатории проф. А. Ван Бругген, Университет Вагенин-гена, Нидерланды. Pseudomonas fluorescens 32 gfp получена от д-ра Роналда Дж. Сэйлера (биологический факультет, университет Арканзаса, США). Исследования проводились с антибиоти-коустойчивыми и авирулентными штаммами (гены вирулентности удалены).
S. Typhimurium выявляли на среде, содержащей г/л: дрожжевой экстракт - 5, бактопептон - 10, агар - 17, вода дистиллированная. рН среды 7.2-7.4. Добавляли антибиотик налидиксовая кислота (50 мг/л). После автоклавирования вносили стерилизованный фильтрацией антибиотик канами-цин (50 мг/л). E. coli O157:H7 gfp выявляли на среде, содержащей г/л: дрожжевой экстракт - 5, бактопептон - 10, NaCl - 10, агар - 17, вода дистиллированная. рН среды 7.2-7.4. После автоклавирования вносили стерилизованный фильтрацией антибиотик ампициллин (50 мг/л). P. fluorescens 32 gfp выявляли на среде, содержащей г/л: бактопептон - 2; К2НРО4 - 1.4; MgSO4 ■ 7H2O - 1.5; глицерин - 15 мл/л; агар - 17, вода дистиллированная. рН среды 7.0-7.2. После автоклавирования вносили стерилизованные фильтрацией антибиотики канамицин (50 мг/л) и рифампицин (50 мг/л) [4]. Все среды автоклавировали при 0.5 атм в течение 30 мин.
Бактерии для интродукции в ЭКРС выращивали в тех же, но жидких средах до достижения начальной стадии стационарной фазы роста (~24 ч для S. Typhimurium gfp и 15 ч для E. coli O157:H7 gfp и P. fluorescens 32 gfp). Температура выращивания бактерий составляла 37°С для S. Typhimurium gfp и E. coli O157:H7 gfp и 25°С для P. fluorescens 32 gfp. Собранную биомассу отмывали один раз дистиллированной водой, а потом ресуспенди-ровали в минимальном количестве дистиллированной воды.
Наряду с определением численности интроду-центов определяли и численность аборигенных бактерий методом посева на среду для учета ко-пиотрофных бактерий [21].
Экскременты крупного рогатого скота были собраны на ферме КРС ЗАО "Московский конный завод № 1" Одинцовского р-на Моск. обл. Рацион кормления животных включал кг/особь в сутки: зеленая масса - 2.5; сено - 1; комбикорм сухой - 3.0; соль на зеленую массу - 40 г. В экспериментах использовали свежесобранные экскременты. Исходная влажность экскрементов в среднем составляла 70%, pН - 7.1.
Почва. Использовали дерново-подзолистую почву, отобранную в мае 2005 г. в Ботаническом саду МГУ им. М.В. Ломоносова недалеко от растений облепихи (Hippophae rhamnoides L.) с глубины 0-15 см. Почву просеивали через сито (ячейки 2 мм) и хранили в полиэтиленовом пакете при комнатной температуре при влажности 6%. Почва содержала общего углерода - 39.6 мг/г, общего азота - 2.87 мг/г, азота аммонийного - 3.75 мкг/г, азота нитратного - 85.5 мкг/г, фосфора в виде фосфат-ионов - 17.7 мкг/г, рН почвы - 6.6. Фракционный состав почвы был следующим (среднее в объемных %): глина - 11.65; песок - 31.8 и илистые частицы - 56.55.
Растения. Для выявления способности ин-тродуцентов колонизировать растения использовали кресс-салат (Lepidium sativum L.) сорта Витаминный, производитель "Агрофирма Аэлита", всхожесть семян 92.5%.
Беспозвоночные животные. Для проверки вероятности выживания исследуемых бактерий при прохождении их через ЖКТ беспозвоночных использовали виноградных улиток (Helix pomatia L.), собранных в Ботаническом саду МГУ. В лаборатории улиток содержали в стеклянных емкостях при 18-20°С и кормили листьями капусты и тонкими срезами моркови.
Динамика прогревания ЭКРС при циклически меняющейся температуре в зависимости от объема ЭКРС. Экскременты массой 0.5, 1.0 и 2.0 кг. ЭКРС помещали в пластиковые горшки, закрывали пищевой полиэтиленовой пленкой, в каждый горшок в середину субстрата вставляли термометр. Эксперимент проводили в трех повтор-ностях. Режим инкубирования составлял 8 ч при 25°С и 16 ч при 15°С. В качестве контроля были проведены аналогичные эксперименты с постоянной температурой 18°С.
Определение водорастворимого органического углерода в ЭКРС, почве и их смеси проводили в водных экстрактах бихроматным методом с пересчетом по калибровочной кривой, построенной после проведения серии таких же реакций с разными концентрациями глюкозы.
Инокуляция бактериями ЭКРС. Исходную численность бактерий в суспензии для интродукции в ЭКРС и в последующем в разных
субстратах определяли люминесцентной микроскопией (МИКМЕД 2 ЛЮМАМ РПО 11, Санкт-Петербургское ОМО) и высевом на селективные среды с соответствующими антибиотиками. Чашки с энтеробактериями инкубировали при 37°С, а с псевдомонадами при 25°С. Флуоресцирующие колонии выявляли и учитывали под темно-голубым светом лампы (black-light lamp, Philips, Eindhoven, Netherlands).
ЭКРС с суспензией соответствующей бактерии смешивали в прочных полиэтиленовых мешках. Объем суспензии подбирали таким образом, чтобы конечная влажность ЭКРС не превышала 90%. Навески ЭКРС в количестве 500 г вносили в пластиковые емкости объемом 0.7 л, закрывали пищевой полиэтиленовой пленкой и инкубировали в темноте и при циклически меняющейся температуре, как отмечено выше. Инокуляцию ЭКРС проводили через 4 суток инкубации в термостате при циклически меняющейся температуре.
Смешивание ЭКРС с почвой. М
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.