ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2010, № 3, с. 318-323
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 579.64:631.46
ПЕРЕМЕЩЕНИЕ ЭНТЕРОПАТОГЕННЫХ И САПРОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ В ЦИКЛЕ ЭКОНИШ: ЖИВОТНЫЕ-ЭКСКРЕМЕНТЫ-ПОЧВА-РАСТЕНИЯ-ЖИВОТНЫЕ © 2010 г. А. А. Куприянов*, А. М. Семенов*, А. Х. К. Ван Бругген**
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический ф-т, каф. микробиологии
119992 Москва, Ленинские горы, корп. 1/12 **Университет г. Вагенинген, группа органического земледелия, Нидерланды, 78560Вагенинген, ул. Марикевег, 22
E-mail: aakupriyanov@mail.ru Поступила в редакцию 24.12.2008 г.
Количественно исследована возможность перемещения популяций сапротрофных и энтеропато-генных бактерий по цепи природно-взаимосвязанных местообитаний — субстратов: корм-желудочно-кишечный тракт животных-экскременты животных-почва-растения и опять животные с образованием цикла. Установлено, что все бактерии, использованные в экспериментах, успешно преодолевают все механические, физико-химические и биологические барьеры в пищевой цепи и выходят в окружающую среду с достаточно высокой численностью. Показано, что именно одна и та же популяция бактерий может проходить весь цикл без привнесения дополнительно численности от аналогичных популяций извне.
Бактерии Salmonella spp., Escherichia coli О157:Н7 являются наиболее распространенными возбудителями пищевых отравлений (Brackett, 1999; Rangel etal., 2005). Традиционно считается, что крупный рогатый скот (КРС) — главный переносчик таких энтеропатогенов, как Salmonella spp. и E. coli О157 : Н7. В их экскрементах может обнаруживаться более 104 колоний образующих единиц на грамм (КОЕ/г) этих бактерий и, следовательно, экскременты КРС (ЭКРС) могут служить источником контаминации окружающей среды (Omisakin et al, 2003). В стадах КРС может иметь место горизонтальный перенос энтеропатогенов от инфицированного животного к здоровому посредством "разбрызгивания" экскрементов, облизывания особей друг друга и др. (McGee et al., 2004).
E. coli О157 может выявляться в течение длительного периода времени в навозе и почве, а Salmonella enterica var. Typhimurium способна выживать значительный период времени еще и в навозной жиже (Himathongkham et al., 1999). В почве после внесения навоза E. coli О157 : Н7 и Salmonella spp. способны выживать от нескольких недель до нескольких месяцев (Islam et al., 2004). Длительность "носи-тельства" животными энтеропатогенов и последующее выживание их в экскрементах зависит от генотипа животного, его возраста (Cray, Moon, 1995) и диеты (Buchko et al., 2000).
Помимо КРС, другие дикие и домашние животные могут быть носителями и распространителями энтеропатогенов (Rice et al., 2003). Важными переносчиками энтеропатогенов являются
грызуны, в частности, дикие кролики и крысы (Nielsen et al., 2004).
В подавляющем большинстве исследований, связанных с выявлением динамики этих микроорганизмов в природе, исследователи ограничиваются прослеживанием их наличия и численности только в отдельном природном субстрате или местообитании (Natvig et al., 2004). Однако, как уже было отмечено, существует проблема перемещения микроорганизмов из одного местообитания в другое, а тем более перемещения через несколько местообитаний по цепи и даже с образованием цикла, при котором происходит инокулирование этих местообитаний (Литвин и др., 1997; Semenov et al., 2004; Семенов, 2005). Такой вариант распространения как сапротрофных, так и энтеропатогенных микроорганизмов остается малоизученным, хотя указания на существование такого цикла высказывались давно, а само явление несомненно важнее и интереснее, чем просто выживание микроба в одном субстрате (Мишустин и др., 1979; Бухарин, Литвин, 1997; Литвин и др., 1997). Таким образом, как фундаментальным, так и прикладным аспектом проблемы является выявление факта перемещения микроорганизмов через различные, но взаимосвязанные местообитания в виде цикла и количественные закономерности таких перемещений.
Целью исследования было изучение популяци-онной динамики сапротрофных и аналогов энтеро-патогенных бактерий, которые были инокулирова-ны крупному рогатому скоту с кормом с последующим прослеживанием и учетом их в экскрементах этих животных, почве, после смешивания ее с экс-
ПЕРЕМЕЩЕНИЕ ЭНТЕРОПАТОГЕННЫХ И САПРОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ
319
крементами, на растениях, выращенных на такой смеси и в экскрементах других животных после скармливания им этих растений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследований были генетически маркированные бактерии, способные синтезировать зеленый флуоресцирующий белок (GFP): S. enterica var. Typhimurium MAE 110 gfp (S. Typhimu-rium gfp), полученная от Ю. Рёмлинг (микробиологический центр, Каролевский институт, Стокгольм, Швеция), Escherichia coli O157 : H7 gfp, полученная из лаборатории А. Ван Бругген (университет Ваге-нингена, Нидерланды), Pseudomonas fluorescens 32 gfp, полученная от Р. Дж. Сэйлера (биологический ф-т, Ун-т Арканзаса, США). Исследования проводились с антибиотикоустойчивыми и авирулентны-ми штаммами (гены вирулентности удалены).
S. Typhimurium gfp выявляли на среде: дрожжевой экстракт — 5 г/л, бактопептон — 10 г/л, агар — 17 г/л, вода дистиллированная 1 л, рН среды 7.2— 7.4. Среду стерилизовали при повышенном давлении в 0.5 атм. в течение 30 мин с антибиотиком (на-лидиксовая кислота 50 мг/л). После автоклавирова-ния вносили стерилизованный фильтрацией антибиотик канамицин 50 мг/л. E. coli O157 : H7 gfp выявляли на среде: дрожжевой экстракт — 5 г/л, бактопептон —10 г/л, NaCl — 10 г/л, агар — 17 г/л, вода дистиллированная 1 л, рН среды 7.2—7.4. Среду стерилизовали при повышенном давлении в 0.5 атм. в течение 30 мин. После автоклавирования вносили стерилизованный фильтрацией антибиотик ампициллин —50 мг/л. P. fluorescens 32 gfp выявляли на среде: бактопептон — 2 г/л; К2НРО4 — 1.4 г/л; MgSO4 • 7H2O — 1.5 г/л; глицерин —15 мл/л; агар — 17 г/л, вода дистиллированная 1 л, рН среды 7.0— 7.2. Среду стерилизовали при повышенном давлении в 0.5 атм. в течение 30 мин. После автоклави-рования вносили стерилизованные фильтрацией антибиотики канамицин —50 мг/л и рифампицин — 50 мг/л.
Биомассу бактерий для интродукции в желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) КРС выращивали в тех же, но жидких средах. Бактерии выращивали до достижения начальной стационарной фазы роста (~24 ч для S. Typhimurium gfp и 15 ч для E. coli O157 : H7 gfp и P. fluorescens 32 gfp). Температура выращивания бактерий составляла 37°С для S. Typhimurium gfp и E. coli O157 : H7 gfp и 25°С для P. fluorescens 32 gfp.
В экспериментах по выживанию исследуемых бактерий при прохождении их через ЖКТ КРС использовали коров-нетелей черно-пестрой породы в возрасте 1 года.
Для проверки вероятности выживания исследуемых бактерий при прохождении их через ЖКТ гры-
зунов использовали обыкновенных полевок (Micro-tus arvalis) и морских свинок (Cavia aperea).
ЭКРС были собраны на ферме КРС ЗАО "Совхоз Москворецкий" (Одинцовский р-н Московской обл.), pH ЭКРС 7.4. Рацион кормления животных включал: зеленая масса — 2.5 кг/особь/сутки (кг/ос./сут); сено — 1 кг/ос./сут; комбикорм сухой — 3 кг/ос./сут; соль на зеленую массу — 40 г/ос./сут. В экспериментах использовали свежесобранные экскременты. Исходная влажность экскрементов в среднем составляла 70%.
Использовали дерново-подзолистую окультуренную почву, отобранную в Ботаническом саду МГУ вблизи (около 2 м) свежих посадок облепихи (Hippophae rhamnoides L.) с глубины 0—10 см. Почву просеяли через сито с размером ячеек 2 мм, подсушили и хранили в полиэтиленовом пакете при комнатной температуре, влажность после просушивания составила 6%. Почва содержала: общего углерода — 39.6 мг/г, общего азота — 2.87 мг/г, азота аммонийного — 3.75 мкг/г, азота нитратного — 85.5 мкг/г, фосфора в виде PO4 — 17.7 мкг/г, рН почвы 6.64. Фракционный состав почвы (среднее в объемных %): глина — 11.65; песок — 31.8 и илистые частицы — 56.55.
В экспериментах использовали растения овса (Avena sativa, "Агрофирма Аэлита", Московская обл., всхожесть семян 85%).
Для определения динамики роста бактерий в суспензии комбикорма 12 г комбикорма (ячмень, отруби, пшеница, шрот рапсовый, жмых подсол-нечниковый, с добавлением соли и микроэлементов) смешивали со 100 мл нестерильной водопроводной воды. Суспензии комбикорма инокулиро-вали соответствующими бактериями в размере приблизительно 102 КОЕ/г сух. вещества и инкубировали на качалке при 250 об./мин в течение 30 ч при температуре 25°С для P. fluorescens 32 gfp и 37°С для S. Typhimurium gfp и E. coli O157 : H7 gfp. В динамике отбирали пробы и производили учет КОЕ с пересчетом на грамм сухого комбикорма.
Проверку вероятности выживания бактерий при прохождении через ЖКТ КРС с пищей исследовали путем скармливания им 1.5 кг предварительно "запаренного" (смесь 1 кг комбикорма с 500 г горячей воды) и охлажденного комбикорма, содержащего 107 КОЕ/г сухого комбикорма соответствующих бактерий.
Эксперимент проводили 3 раза с разными коровами, т.е. всего 9 коров для каждой бактерии. Животных кормили утром, комбикорм давали в кормушки для каждой коровы.
Через 24 ч после инокуляции собирали образцы ЭКРС и учитывали в них искомые бактерии посевом 100 мкл приготовленной суспензии на каждую чашку Петри с селективной питательной средой и соответствующими антибиотиками. Чашки с энте-робактериями инкубировали при 37°С, а с псевдо-
320
КУПРИЯНОВ и др.
Время, ч
Рис. 1. Динамика роста исследуемых бактерий в суспензии комбикорма. 1 — S. Typhimurium MAE 110 gfp;
2 — E. coli O157 : H7 gfp; 3 - P. fluorescens 32 gfp.
монадами при 25°С. Флуоресцирующие колонии выявляли и учитывали под темно-голубым светом лампы (a black-light lamp, 220 V, 11 wt, PL-S, Philips, Eindhoven, Нидерланды). Количество КОЕ пересчитывали на 1 г сухого вещества. Влажность образцов определяли путем их высушивания в течение нескольких часов при 105°С.
Для определения динамики выживания бактерий в ЭКРС навески собранных ЭКРС в количестве 500 г вносили в пластиковые емкости объемом 0.7 л. Емкости закрывали пищевой полиэтиленовой пленкой и инкубировали в темноте при пост
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.