БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 9, с. 1124 - 1134
УДК 577.3
ПЕРИОДИЧЕСКИЕ ОСЦИЛЛЯЦИИ ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА В ПРОЦЕССЕ ФОРМИРОВАНИЯ ЕГО МЕМБРАННОЙ СЕТИ, ВЫЯВЛЕННЫЕ МЕТОДОМ ДИНАМИЧЕСКОЙ ФАЗОВОЙ МИКРОСКОПИИ
© 2014 Т.В. Вышенская13, В.П. Тычинский23, Д.Г. Вайсс3, С.А. Кузнецов13*
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, физический факультет, биологический факультет, 119899 Москва
2 Московский государственный технический университет
радиотехники, электроники и автоматики, факультет оптоэлектроники, 117454 Москва 3 Institute of Biological Sciences, University of Rostock, Albert-Einstein-Str. 3, 18059 Rostock, Germany; fax: +49(381)-4986302, E-mail: sergei.kuznetsov@uni-rostock.de
Поступила в редакцию 11.04.14 После доработки 26.05.14
Метод динамической фазовой микроскопии (ДФМ) был использован для изучения явлений, происходящих в процессе образования сети эндоплазматического ретикулума (ЭПР-сети) в экстрактах икринок лягушки Xenopus, деление которых было задержано на стадии интерфазы. Мы показали, что в процессе формирования трубчатой сети in vitro ЭПР был подвержен периодическим осцилляциям, происходящим с частотой в диапазоне 1,6—2,2 Гц и зависящими от наличия АТР. Спектральная плотность, то есть изображение с данной частотной компонентой на спектре Фурье, строго коррелировала с динамическими изменениями, происходящими в зависимом или независимом от микротрубочек процессе формирования ЭПР-сети, наблюдаемого методами дифференциальной интерференционной контрастной микроскопии и флуоресцентной микроскопии. Поскольку осцилляция с частотой 1,6—2,2 Гц в процессе формирования сети происходила как в присутствии, так и в отсутствие микротрубочек, то кажется вероятным, что эта осцилляция является свойством мембран ЭПР, зависящим от присутствия АТР. Несколько характерных активных и неактивных стадий формирования ЭПР-сети наблюдалось как в присутствии, так и в отсутствие микротрубочек. Однако анализ данных с этих стадий показывает, что микротрубочки и активность динеинового транспортного комплекса оказывают существенное влияние и действуют совместно на кинетику образования ЭПР-сети, контролируя реакцию слияния мембранных комплексов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: эндоплазматический ретикулум, осцилляция мембран, слияние мембран, микротрубочки, динеин, Xenopus.
Эндоплазматический ретикулум (ЭПР) является крупной органеллой, формирующей пространственную полигональную сеть трубчатых мембран, распространяющуюся по всей клетке (ЭПР-сеть). Эта структура очень динамична и постоянно подвергается формирова-
Принятые сокращения: УЕС-БГС микроскопия — дифференциальная интерференционная контрастная микроскопия с усиленным видеоконтрастом, ДФМ — динамическая фазовая микроскопия, ОРХ — оптическая разность хода, ЭПР — эндоплазматический ретикулум, ЭПР-сеть — трубчатая сеть эндоплазматического ретикулума.
* Адресат для корреспонденции.
нию новых мембранных трубок, которые сливаются друг с другом и перемещаются относительно друг друга [1, 2]. Прекрасной моделью для изучения формирования ЭПР-сети in vitro являются изолированные экстракты икринок лягушки Xenopus laevis, задержанных в своем делении на стадии интерфазы или метафазы (интерфазные или метафазные экстракты). С использованием интерфазных экстрактов Алан и Вейле [3, 4], а также Стеффен с соавт. [5] продемонстрировали, что микротрубочки и связанный с ними цитоплазматический траспортер динеин принимают участие в формировании ЭПР-сети и иг-
рают центральную роль в стимуляции ее образования. Формирование ЭПР-сети при слиянии мембранных структур между собой в интерфазных экстрактах может также происходить независимо от микротрубочек и их транспортной системы, для чего необходимы другие, пока не идентифицированные цитозольные факторы [6, 7]. Однако при этом для создания ЭПР-сети требуется в 3—4 раза больше времени [6, представленная статья]. По-видимому, в интерфазных экстрактах в формировании ЭПР-сети принимают участие оба механизма, зависимый и независимый от микротрубочек, и в обоих случаях необходимо наличие АТР [3, 6]. Остается неясным, насколько эти два механизма взаимосвязаны in vivo и in vitro. ЭПР-сеть была прослежена также и в экстрактах икры, блокированных на стадии метафазы [8]. Но в этом случае процесс формирования ЭПР-сети зависел не от микротрубочек, а от генерированной миозином V подвижности ЭПР мембран вдоль актиновых фила-ментов [8].
Для детального изучения процесса образования ЭПР-сети во времени и пространстве мы применили метод динамической фазовой микроскопии (ДФМ), позволяющий количественно измерять динамические изменения ЭПР в процессе формирования его сети вблизи поверхности стекла или во всей толще раствора. Мы установили, что в интерфазных экстрактах ЭПР в процессе формирования подвергался периодическим флуктуациям с частотой ~2 Гц. Подобные осцилляции были присущи самой формирующейся ЭПР-сети, так как наблюдались и в присутствии, и в отсутствие микротрубочек. Однако микротрубочки и активность динеина не только стимулировали образование ЭПР-сети, но также возбуждали ее осцилляцию и изменяли динамические свойства эндоплазматических мембранных структур.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Динамическая фазовая микроскопия (ДФМ) [9—11] была использована для изучения динамики процессов, протекающих в цитоплазма-тических экстрактах икры Xenopus. Метод ДФМ основан на допущении, что любой процесс, происходящий внутри интересующего объекта или в связи с ним (конформационный переход, перемещение частиц и т.д.), оказывается связанным с изменением результирующего коэффициента преломления и соответствующего значения оптической разности хода (ОРХ). Для объектов, находящихся в динамике, локальное значение ОРХ в какой-либо точке непостоянно
во времени. Поэтому, периодически регистрируя ОРХ в данной конкретной точке объекта, можно получить информацию о динамике локального процесса. Одновременная регистрация значений ОРХ во многих различных точках позволяет увязать процесс с конкретным местом в пространстве. Записи зависимостей значений ОРХ от времени, преобразованные в цифровую форму (так называемые трек-диаграммы), были получены путем периодического сканирования вдоль выбранного направления (линия сканирования) и сохранены для дальнейшего анализа. Вид трек-диаграммы для конкретной точки на линии сканирования дает информацию в развитии процессов, протекающих в этой точке во времени, и содержит данные об интенсивности флуктуации в данном месте в пространстве. Преобразование трек-диаграммы по алгоритму Фурье приводит к получению соответствующего спектра локальных флуктуаций ОРХ. Сумма этих спектров во всех точках вдоль линии сканирования была представлена как двумерное (2D) изображение спектра, показывающее расположение и спектральную плотность p(x,F) зон с доминирующими частотами флуктуаций ОРХ в каждой точке вдоль направления сканирования. Высокая точность измерения локальных флуктуаций ОРХ является основным преимуществом ДФМ, поскольку обеспечивает 4-6-кратное превышение предела разрешающей способности классических методов для объектов с достаточно высокими значениями ОРХ.
Использованный в работе оснащенный компьютером фазовый микроскоп («Airyscan», Россия) является интерференционным микроскопом по схеме Линника с фазовой модуляцией несущей волны [11, 12]. В качестве источника когерентного светового излучения был использован He-Ne-лазер (X = 633 нм, мощность 1 мВ), а передающая телевизионная трубка модели LI-620 («Elektron», Россия) была использована в качестве координатного фотодетектора. Размеры обзорного поля могли меняться в зависимости от используемых увеличивающих линз от 5 х 5 до 50 х 50 мкм2.
Сбор и обработку данных выполняли с использованием пакета аналитических компьютерных программ MIREA (Москва, Россия). Время сбора данных для создания цифрового фазового изображения составляло 16,4 с и проводилось с помощью растра 128 х 128 пикселей с размером поля 8 х 8 мкм2; чувствительность, лимитированная «шумами», Имин = 0,5 нм. Программное обеспечение создавало псевдоцветное изображение объекта в виде значений ОРХ для каждого пикселя.
Дифференциальная интерференционная контрастная микроскопия с усиленным видеоконтрастом (VEC-DIC микроскопия) и флуоресцентная микроскопия. VEC-DIC микроскопия [13—15] была выполнена, как описано в работах Стеф-фан с соавт. [5] и Воллерт с соавт. [8]. Мы использовали инвертированный микроскоп Nikon Diaphot 300 («Nikon GmbH», Германия), укомплектованный масляным иммерсионным кон-денсером (NA 1.4), масляным объективом 100x DIC PlanApo (NA 1.4) и ртутной дуговой лампой (HBO 100). Для захвата изображений была использована цифровая камера Hamamatsu C2400-07 Newvicon («Hamamatsu Photonics Deutschland GmbH», Германия). Для аналогового и цифрового преобразования сигналов при VEC-DIC микроскопии использовали процессор изображений в реальном времени модели ARGUS 20 («Hamamatsu Photonics», Япония). Изображения записывались прямо с ARGUS 20 в компьютер, укомплектованный картой захвата изображения LG-3 («Scion Corporation», США), с помощью программы IPLab Spectrum («Scanalytics Inc.», США).
Для флуоресцентной микроскопии был использован микроскоп Nikon Eclipse 800 («Nikon GmbH», Германия), укомплектованный масляным иммерсионным конденсером (NA 1.4), масляным объективом 60x DIC PlanApo oil (NA 1.4) и ртутной дуговой лампой (HBO 100). Для захвата флуоресцентных изображений использовали спот-камеру («Visitron Systems GmbH», Германия). Изображения покадрово переписывали в компьютер с использованием программы MetaMorph («Universal Imaging Inc.», США).
Подготовка образцов. Интерфазный цитоплаз-матический экстракт икры Xenopus получали, как описали Стеффен с соавт. [5]. Для исследований методом ДФМ отбирали из экстракта аликвоты по 5—7 мкл, добавляли к ним 3 объема буфера (100 мМ NaAc, 10 мМ HEPES, 2,5 мМ MgAc, 5 мМ ЭГТА, рН 7,2, 50 мМ сахароза, 1 мМ дитиотреитол), содержавшего 2 мМ АТР или АТР-регенерирующую систему (1 мМ ATP, 50 мкг/мл креатинкиназы + 10 мМ креатинфосфат), и помещали в камеру, состоявшую из покровного стекла и небольшой полированн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.