УДК 576.311.348.7;576.311.346.2
ПЕРОКСИД ВОДОРОДА, СТИМУЛИРУЮЩИЙ МИГРАЦИЮ ФИБРОБЛАСТОВ, ОБРАЗУЕТСЯ В МИТОХОНДРИЯХ
© 2014 г. Л. С. Венкова, И. С. Черноиваненко, А. А. Минин*
Институт белка РАН, 119334, Москва, ул. Вавилова, 34; *электронная почта: alexminin@gmail.com Поступила в редакцию 28.05.2014 г.
Пероксид водорода (H2O2) участвует в регуляторных процессах, связанных с миграцией клеток, но механизмы этой регуляции пока мало изучены. Так, не ясно, какой из известных источников H2O2 в клетке принимает непосредственное участие в регуляции миграции фибробластов. В настоящей работе изучалась роль митохондрий как одного из основных источников H2O2 в клетке в миграции фибробластов. В качестве модели использовали спонтанно мигрирующие мышиные фибробласты в редкой культуре. Добавление N-ацетил-цистеина (NAC) — антиоксиданта, полностью блокирующего действие H2O2, значительно снижало скорость миграции клеток. Лишенные митохондриаль-ной ДНК р0-клетки, в которых нарушена дыхательная цепь и, как следствие, не образуется H2O2, были нечувствительны к NAC. Наши данные свидетельствуют о том, что основным источником H2O2, регулирующего миграцию клеток, являются митохондрии.
Ключевые слова: митохондрии, пероксид водорода.
DOI: 10.7868/S0233475514050090
ВВЕДЕНИЕ
Миграция клеток играет важную роль в процессах эмбрионального развития, воспаления (лейкоциты и лимфоциты), заживления ран (фибробласты), в метастазировании опухолей [1]. Миграция клеток в организме регулируется внешними факторами, но в культуре клеток наблюдается и спонтанная миграция.
Пероксид водорода (Н2О2) в последнее время рассматривается как потенциально важный регулятор миграции клеток, действующий как снаружи в роли хемоаттрактанта, так и внутри клетки и в качестве вторичного посредника [2]. Так у личинки Danio rerio на краях раны обнаружен устойчивый градиент концентрации Н2О2, управляющий миграцией лейкоцитов в направлении раны [3]. Кроме того, Н2О2 способствует полимеризации актиновых микрофиламентов [4], увеличивая скорость сборки [5] и изменяя эластичность волокон [6], участвуя таким образом в структурных перестройках актинового цитоскелета.
На возможную роль Н2О2 в поляризации клеток, необходимой для миграции, указывают данные более поздних работ. Показано, что Н2О2, в образовании которого участвует малая GTP-аза Racl, вовлечен в передачу сигнала от интегрино-вых рецепторов, необходимых для адгезии и рас-
пластывания клеток [7]. Участие Н2О2 основано на его способности окислять остатки цистеина в активном центре некоторых ферментов, например, некоторых фосфатаз, ингибируя их активность. Кроме того, активные формы кислорода (АФК) вызывают активацию и транслокацию ЯИо-киназы, ответственной за формирование сократительных структур [8], ингибируя в то же время малую ОТР-азу ЯИоА [9].
При помощи белковых биосенсоров на основе химерного белка НуРег, чувствительных к Н2О2 [10, 11], выявлена неоднородность распределения Н2О2 в цитоплазме клеток при их поляризации. В передней части мигрирующих клеток уровень пе-роксида был выше, чем в задней [12]. Согласно [12], такая неоднородность Н2О2 обусловлена активацией МЛЭРН-оксидаз, локализованных на плазматической мембране.
Одним из основных источников Н2О2 в клетках являются митохондрии, в которых он образуется в процессе одноэлектронных реакций восстановления кислорода компонентами дыхательной цепи, а также в результате работы мембранных МЛЭРН-оксидаз [13]. Показано, что в третьем комплексе дыхательной цепи образуется больше АФК, чем в других возможных местах [14].
В настоящей работе использовали р0-клетки, лишенные митохондриальной ДНК (мтДНК), от-
сутствие которой привело к нарушению дыхательной цепи митохондрий. В отсутствие транспорта электронов дыхательная цепь в митохондриях р0-клеток не может быть источником АФК [14, 16]. Оказалось, что скорость миграции таких клеток ниже, чем клеток исходной линии, и нечувствительна к действию NAС. Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что основным источником АФК, участвующего в регуляции миграции клеток, являются митохондрии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культура клеток. В работе использовали мышиные фибробласты линии MFT-6 [15]. Клетки культивировали в среде DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, ПанЭко, Россия), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Биолот, Россия), 100 мкг/мл пенициллина (Sigma, США), 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma, США), при температуре +37°С, во влажной атмосфере с 5% содержанием СО2.
Для получения р0-клеток клетки MFT-6 культивировали в среде, содержащей 0.1 мкг/мл бромида этидия, 50 мкг/мл уридина, 110 мкг/мл пи-рувата, в течение 6 нед [16].
NAС (Sigma, США) добавляли до конечной концентрации 2.5 мМ за 1 ч до съемки.
Окрашивание митохондрий. Митохондрии окрашивали флуоресцентным митохондриаль-ным красителем TMRE (Molecular Probes, США). Клетки инкубировали в течение 1 ч при 370С в среде, содержащей 25 нМ красителя. Чтобы исключить выброс красителя из клеток Р-гликопро-теином, продуктом гена множественной лекарственной устойчивости, в среду инкубации добавляли ингибитор Р-гликопротеина верапамил в концентрации 2.2 мкМ [17].
Микроскопия. Покровные стекла с клетками заключали в герметичную камеру со средой DMEM и помещали в микроскоп Axiovert 200 М (Carl Zeiss, Германия), снабженный инкубатором, в котором поддерживали температуру 36 ± 2°C (PeCon, Германия). Съемку поводили при помощи фазового контраста через объектив Plan-Neofular x 10, 12-битной цифровой CCD камерой AxioCam MR3 (Carl Zeiss, Германия) и программного обеспечения AxioVision (Carl Zeiss, Германия) с интервалом между кадрами 5 мин.
Флуоресцентную микроскопию проводили при помощи микроскопа Axiovert 200 М, используя объектив PlanApo x63. При съемке живых клеток флуоресценцию возбуждали при помощи 100-ваттной галогеновой лампы. Флуоресценцию TMRE возбуждали светом с длиной волны 579 нм, а регистрировали при 600 нм.
Анализ миграции клеток и обработка изображений. Культуру клеток выращивали до монослоя, а затем стерильным бритвенным лезвием удаляли половину клеток с покровного стекла. Через 10—12 ч, когда отдельные клетки выползали из монослоя на свободное от клеток пространство, анализировали их миграцию. Для определения положения отдельных клеток в каждом кадре отмечали точкой положение их ядра (рис. 1) и определяли его координаты. По отмеченным точкам строили траектории движения клетки. Длины траекторий определяли при помощи программы ImageJ, среднюю скорость движения клетки вычисляли как отношение длины траектории ко всему затраченному на передвижение времени. Затем рассчитывали средние значения скорости всех клеток. Результаты представляли в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (SEM). Для получения каждого среднего значения проводили от 4 до 13 независимых опытов. Указано суммарное число клеток, проанализированных во всех экспериментах.
Анализ мтДНКв р0-клетках при помощи ПЦР.
Полноту удаления мтДНК в клетках в результате культивирования в присутствии бромида этидия контролировали при помощи ПЦР с использованием праймеров, комплементарных гену цито-хрома b, кодируемому мтДНК. В качестве матрицы использовали суммарную ДНК, выделенную из клеток, и праймеры TGATATGAAAAACCA-TCGTTG и CCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA [18, 19]. В качестве положительного контроля использовали праймеры, комплементарные гену малой GTP-азы Rac1, кодируемому ядерной ДНК, TGAATTCTATGCAGGCCATCAAGTGT и AGGATCCTTACAACAGCAGGCATTTT
РЕЗУЛЬТАТЫ
Миграцию клеток, помещенных в различные условия, мы анализировали на модели редкой культуры спонтанно мигрирующих фибробла-стов. Однако в редкой культуре, полученной обычным способом, значительная часть клеток оказывается неподвижной, что затрудняет оценку средней подвижности клеток всей культуры. Чтобы решить эту проблему, мы отбирали способные к миграции клетки, используя экспериментальную рану, так как только подвижные клетки оказываются вне монослоя через 10—12 ч и представляют собой редкую культуру. На рис. 1 видно, что движение отдельных клеток было неравномерным по скорости, направление его часто менялось. Анализ длины отрезков, преодолеваемых клетками за пятиминутные интервалы, показал, что их распределение было нормальным, что позволяло рассчитывать среднюю скорость каждой
15 мин S
/
L ^ Г
- Ч
б : ■ ,
30 мин
30 мин
А ^ П Ov^" °
г^-Ч Ч I Г^Ч >
г
в
Рис. 1. Анализ миграции отдельных клеток. а — Отдельные клетки; б, в — построение траектории движения анализируемой клетки; г — измерение длины траектории.
Число отрезков Число клеток
< 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.2< < 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 <
Средняя скорость, мкм/мин Средняя скорость, мкм/мин
Рис. 2. Распределение длин отрезков, преодолеваемых клетками за пятиминутные интервалы (а), и средних скоростей миграции отдельных клеток (б).
клетки (рис. 2а). Полученные таким образом средние скорости клеток также имели нормальное распределение (рис. 2б), что позволило определить среднюю скорость для всех клеток данной культуры (рис. 3).
Ранее было показано, что NAC, восстанавливающий Н2О2, подавляет способность клеток к миграции в экспериментальную рану и меняет их морфологию [20]. На рис. 3 видно, что добавле-
ние NAC к фибробластам MFT-6 мыши также снижает скорость их миграции на 40%.
В клетках, лишенных мтДНК, так называемых р0-клетках, отсутствуют некоторые важные компоненты дыхательной цепи. Такие клетки становятся анаэробными и энергию, необходимую в том числе и для поддержания мембранного потенциала митохондрий, получают в процессе гликолиза [21]. В результате этого в митохондриях
р0-клеток не образуется Н2О2, но сохраняются другие источники АФК. На рис. 4 представлены данные, свидетельствующие о полном отсутствии мтДНК в клетках p0-MFT-6 (рис. 4а). Кроме того, видно, что митохондрии в этих клетках обладают мембранным потенциалом, как и в клетках исходной линии MFT-6 (рис. 4в, д).
Показано, что средняя скорость миграции клеток p0-MFT-6 была на 25% меньше, чем в исходной линии MFT-6 (рис. 5), и, что особенно важно, не снижалась при д
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.