научная статья по теме ПЕРОКСИДАЗА КАК КОМПОНЕНТ СИГНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ КЛЕТОК КАРТОФЕЛЯ ПРИ ПАТОГЕНЕЗЕ КОЛЬЦЕВОЙ ГНИЛИ Биология

Текст научной статьи на тему «ПЕРОКСИДАЗА КАК КОМПОНЕНТ СИГНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ КЛЕТОК КАРТОФЕЛЯ ПРИ ПАТОГЕНЕЗЕ КОЛЬЦЕВОЙ ГНИЛИ»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 5, с. 692-697

УДК 581.1

ПЕРОКСИДАЗА КАК КОМПОНЕНТ СИГНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ КЛЕТОК КАРТОФЕЛЯ ПРИ ПАТОГЕНЕЗЕ КОЛЬЦЕВОЙ ГНИЛИ

© 2004 г. И. А. Граскова, Г. Б. Боровский, А. В. Колесниченко, В. К. Войников

Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук, Иркутск Поступила в редакцию 10.02.2003 г.

Изучали функционирование НАДФН-оксидазной сигнальной системы клеток картофеля на примере изменения активности фермента пероксидазы. При патогенезе кольцевой гнили активность фермента резко увеличивалась. Определены два механизма увеличения активности пероксидазы. Один из них характерен для клеток восприимчивого к патогену сорта картофеля и связан с синтезом фермента de novo. Другой механизм, характерный для клеток устойчивого сорта картофеля, связан с синтезом фермента de novo, а также и с активацией существовавших до бактериального заражения молекул фермента. Бактериальное заражение, как и действие экзополисахаридов, выделяемых патогенном, вызывали изменения в спектрах внутри- и внеклеточных пероксидаз восприимчивого к этому патогену сорта картофеля, но не вызывали изменения спектров изопероксидаз устойчивого сорта. Но в последнем случае происходила резкая активация внеклеточной изоформы с Rf 15.

Solanum tuberosum - Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus - патогенез - пероксидаза - изоформы

Современные исследователи проявляют все большее внимание изучению молекулярных механизмов взаимодействия патогенов и растений, начинающихся с их контакта и завершающегося формированием ответа растения и подавления развития патогена [1-3]. Большую роль в формировании устойчивости к патогенам у растений играют сигнальные системы клеток, принимающие участие в рецепции, передаче и усилении элиси-торных сигналов [4].

Для преодоления иммунитета растения патоген секретирует литические ферменты, специфические и неспецифические иммуносупрессоры, токсины и экзополисахариды [5, 6]. Элиситоры связываются с внешним участком белкового рецептора, расположенного в плазмалемме и вызывают его фосфолирирование, а также изменение его конформации [7]. Затем остаток фосфорной кислоты передается на цитоплазматический участок белка, изменяя его и вызывая активацию пероксидазы, ассоциированной с рецептором [8]. Активация фермента является важнейшим зве-

Сокращения: Cms - Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, ЭПС - экзополисахариды; PR белки - белки, имеющие отношение к патогенезу (pathogenesis related). Адрес для корреспонденции: Граскова Ирина Алексеевна. 664033 Иркутск, а/я 1243. Факс: (3952) 51-07-54; электронная почта: graskova@sifibr.irk.ru.

ном сигнальной системы, которая передает эли-ситорный сигнал и вызывает экспрессию защитных генов, PR-белков, ингибиторов протеиназ, активных форм кислорода, которые определяют защитный ответ клеток на инфицирование [9].

В настоящее время выделяют ряд сигнальных систем, одной из которых является супероксид-синтазная сигнальная система. Окисление НАДФ ■ Н молекулярным кислородом приводит к образованию супероксид-анионов, которые в результате реакции, катализируемой супероксид-дисму-тазой, превращаются в перекись водорода [9]. Резкое повышение содержания активных форм кислорода и перекиси водорода (так называемый "окислительный взрыв") оказывает подавляющее действие на развитие патогена [9]. В то же время активные формы кислорода и перекись водорода являются вторичными посредниками, вызывающими активацию факторов регуляции транскрипции и экспрессию защитных генов [10].

Установлено, что активные формы кислорода образуются в реакциях с участием пероксидазы [11]. Во многих работах показано увеличение активности пероксидазы при патогенезе. Поэтому пероксидазу рассматривают как одну из важнейших каталитических систем среди биохимических факторов защиты растений от патогенных микроорганизмов [11]. Известно, что Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms) вызывает кольцевую гниль клубней и завядание надземной

части растений картофеля [12]. Показано, что при инфицировании вирулентным штаммом 5369 Cms различных сортов картофеля, выращенных в стерильных условиях, происходит увеличение активности пероксидазы растения-хозяина [12].

В то же время остается неясным вопрос о том, за счет чего происходит увеличение его активности: происходит синтез фермента de novo или повышается активность уже имеющихся в клетке, ранее синтезированных молекул. Кроме того, неясно, существуют ли различия в механизме повышения активности пероксидазы в клетках устойчивых и восприимчивых к патогену растений. Поэтому, представляло интерес выяснить, какие механизмы изменения активности фермента задействованы при патогенезе и как это соотносится с работой НАДФН-оксидазной сигнальной системы.

МЕТОДИКА

Растительный материал. В работе были использованы сорта картофеля (Solanum tuberosum L.) Луговской (устойчивый к патогену) и Лукьянов-ский (восприимчивый к патогену). Пробирочные растения выращивали из черенков на агаризиро-ванной MC-среде с добавлением 10 г/л сахарозы ("Реахим", Россия), 1.0 мг/л тиамина, 0.5 мг/л пи-ридоксина, 0.3 мг/л 8-оксихинолина, 0.1 мг/л ИУК ("Sigma", США), 1.0 мг/л аскорбиновой кислоты и 0.02 мг/л феруловой кислоты ("Serva", Германия) [13].

Суспензионные культуры клеток получали из каллусов, выращенных из листовых тканей тех же сортов картофеля. Для этого в 100 мл жидкой питательной MC-среды с добавлением гормонов и витаминов [13] помещали 2-5 мг каллусной ткани и встряхивали на качалке до получения суспензии.

Бактериальный материал. Использовали вирулентный штамм 5369 Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Spieck. et Kotth.) Skapt et Burkh, который был получен из НИИ картофельного хозяйства (пос. Коренево, Московская обл.). Бактерии культивировали на картофельном агаре с 1.5% глюкозой 5-6 сут. Затем их культивировали 3 сут при 25°С на жидкой питательной среде, содержащей 5.0% дрожжевого экстракта ("Sigma"), 1.5% глюкозы, 0.5% СаС03 ("Реахим").

Культивирование суспензионных культур картофеля с бактериями. В колбу помещали 90 мл 7-дневной суспензии клеток (500 клеток/мл) картофеля, добавляли 10 мл бактериальной суспензии (2 х 104 клеток/мл) и культивировали 24 ч при 25°C, затем определяли активность пероксидазы во вне- и внутриклеточных фракциях.

Определение активности пероксидазы. Пе-роксидазную активность анализировали в инфи-

цированных и неинфицированных клетках суспензионной культуры [14]. Для экстракции внеклеточных пероксидаз навески по 450 мг клеток картофеля помещали в шприц, заливали 4 мл холодного цитратно-фосфатного буфера (0.1 М, рН 6.2) и дважды выдерживали при разрежении по 1 мин. Суспензию фильтровали и в фильтрате определяли пероксидазную активность. Для выделения внутриклеточных пероксидаз осадок суспензионных клеток растирали в 2 мл 0.1 М цитратно-фосфатного буфера, рН 6.2. Полученный гомогенат центрифугировали 15 мин при 3000 g, и в супернатанте определяли активность фермента.

Активность пероксидазы измеряли по увеличению оптической плотности при 580 нм в реакционной смеси из 0.5 мл 0.1 М цитратно-фосфат-ного буфера (рН 6.2), 0.5 мл 0.3% Н202 и 0.5 мл 0.05% гваякола ("Sigma"). Активность пероксидазы определяли при 25°C сразу после выделения и рассчитывали по методу Бояркина [14]. Количество белка определяли по методу Lowry с соавт. [15].

Выделение и очистка экзополисахаридов. Вирулентный штамм 5369 бактерии Cms выращивали в колбах при 25°C в стационарных условиях на среде из 10 г/л дрожжевого экстракта ("Sigma") и 15 г/л глюкозы ("Реахим") в течение трех нед. Эк-зополисахариды (ЭПС), продуцируемые бактерией, выделяли и очищали по методу, описанному в

[16]. Бактериальные клетки удаляли из культу-ральной жидкости центрифугированием 30 мин при 20000 g. Надосадочную жидкость последовательно пропускали через колонки с ионообменными смолами Dowex-50 и затем Dowex-1 ("Sigma"). Элюат концентрировали на роторном испарителе под вакуумом до объема 100-150 мл, к которому затем добавляли в 6 раз большие объемы охлажденного ацетона и выдерживали 30 сут при -20°C. После осаждения ЭПС ацетон сливали, осадок высушивали и хранили при 4°C.

Культивирование суспензионных клеток картофеля с экзополисахаридами. В колбу помещали 90 мл 7-дневной суспензии клеток (500 клеток/мл) картофеля, добавляли ЭПС в конечной концентрации 0.1% и культивировали 24 ч при 25°C. Затем определяли активность фермента во вне- и внутриклеточных фракциях.

Электрофорез. Электрофорез проводили в блоках полиакриламидного геля в модифицированной системе Андерсон, Борг и Микаэльсон

[17], на приборе Mini-PROTEAN II фирмы "BioRad" (США) согласно прилагаемой инструкции. Для выявления активности пероксидазы в поли-акриламидном геле использовали диаминобензи-диновый метод [18]. Для этого готовили раствор для инкубации гелей: 15 мг ДАБ (3,3-диаминобен-зидин-4НО) растворяли в 30 мл цитратно-фос-фатного буфера (0.1 М, рН 6.2) и добавляли 0.2 мл 0.3% Н202 . Гели помещали в раствор для инкуба-

л

м ч

о

VO

и

«

о о

се и н

о м

о &

о к л н о о к я н н

м <

(a)

(б)

12 3 4

Вариант

Рис. 1. Изменение пероксидазной активности суспензионных культур клеток картофеля сортов Лукья-новский (а) и Луговской (б) при инфицировании вирулентным штаммом 5369 С. michiganensis зиЬзр. sepe-йотеия и при действии ингибитора белкового синтеза (циклогексимида).

1 - без патогена (контроль); 2 - культивирование с бактериями; 3 - культивирование с бактериями и цик-логексимидом; 4 - контроль плюс циклогексимид.

ции и выдерживали до появления коричневой окраски. Затем инкубационную среду сливали, гели промывали в дистиллированной воде, помещали в цитратно-фосфатный буфер (0.1 М, рН 6.2) и выдерживали 12 ч.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Рис. 1 показывает, что определенный уровень пероксидазной активности присутствует в кон-

трольных, неинфицированных клетках обоих сортов картофеля. Совместное культивирование клеток чувствительного сорта Лукьяновский с патогеном приводило к резкому увеличению активности пероксидазы (рис. 1а). Это увеличение активности фермента полност

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком