УДК 546.173+546.215:612.112.91
ПЕРОКСИНИТРИТ РЕГУЛИРУЕТ ЭКЗОЦИТОЗ ГРАНУЛ НЕЙТРОФИЛОВ
© 2010 г. М. Н. Стародубцева, Е. И. Коваленко*, Н. И. Егоренков**, Д. Р. Петренев***, С. Н. Черенкевич*
Гомельский государственный медицинский университет, ул. Ланге, 5, 246000, Гомель, Беларусь; факс: +375232749831; электронная почта: marysta@mail.ru
*Белорусский государственный университет, пр. Независимости, 4, 220030, Минск, Беларусь; факс: +375172095445; электронная почта: cherenkevich@bsu.by
**Гомельский государственный технический университет им. П.О. Сухого, пр. Октября, 48, 246746, Гомель, Беларусь; факс: +375232479165; электронная почта: Yegorenkov-n@mail.ru
***Институтрадиобиологии НАНРБ, ул. Федюнинского, 4, 246007, Гомель, Беларусь; факс: +375232570706;
электронная почта: Daniil.Petrenyov@gmail.com
Поступила в редакцию 02.02.2010 г.
После доработки 23.04.2010 г.
В организме пероксинитрит образуется в реакции монооксида азота с супероксид-анион-радикалом, которые синтезируются активированными нейтрофилами и макрофагами в очагах воспаления. Пероксинитрит, модифицируя структуры макромолекул нейтрофилов, включая компоненты актинового цитоскелета, может влиять на сигнальные пути, регулирующие экзоцитоз внутриклеточных гранул. С помощью данных, полученных методами проточной цитофлуориметрии, световой и атомно-силовой микроскопии, нами выявлен двойственный характер влияния пероксинит-рита на процесс дегрануляции нейтрофилов. Показано, что пероксинитрит в низких и умеренных концентрациях (до 300 мкМ) активирует экзоцитоз внутриклеточных гранул нейтрофилов, что приводит к увеличению распластывания и адгезии нейтрофилов к субстрату, а также к активации систем, обеспечивающих их антимикробные свойства. В более высоких концентрациях перокси-нитрит подавляет экзоцитоз внутриклеточных гранул и уменьшает распластывание и адгезию нейтрофилов к субстрату. Характер влияния веществ (например, колхицина и цитохалазинов), изменяющих динамику структур цитоскелета, на процессы модификации нейтрофилов пероксинитритом указывает на важную роль актиновых элементов цитоскелета в регуляции пероксинитритом экзо-цитоза внутриклеточных гранул нейтрофилов. Полученные результаты свидетельствуют в пользу гипотезы о пероксинитрите как естественном регуляторе эффекторных функций нейтрофилов.
Ключевые слова: нейтрофилы, экзоцитоз, пероксинитрит, атомно-силовая микроскопия, актин.
Нейтрофилы являются клетками первой линии защиты организма от патогенных микроорганизмов. Уничтожение нейтрофилами патогенов основано на двух взаимодополняющих механизмах: синтезе ими токсичных активных метаболитов кислорода (супероксид-анион-радикала, монооксида азота, пероксинитрита, гипохлорной кислоты и др.) и выделении из внутриклеточных гранул белков, обладающих бактерицидными свойствами. Нейтрофилы человека содержат четыре основных типа гранул: секреторные пузырьки, желатиназные, специфические и азурофиль-ные гранулы. При активации или праймировании нейтрофилов гранулы перемещаются к плазматическим мембранам или мембранам внутриклеточных фагосом. Согласно теории "ступенчатого" экзоцитоза ("graded" exocytosis), наибольшей мобильностью обладают секреторные пузырьки, которые первыми отвечают на стимулирующее
воздействие. Следующие участники экзоцитоза — желатиназные гранулы, затем специфические и, наконец, азурофильные гранулы нейтрофилов [1]. Первая стадия экзоцитоза — прохождение внутриклеточных гранул через кортикальный (подмембранный) цитоскелет и их последующий контакт (слияние) с плазматической мембраной, в процессе которого мембраны гранул становятся частью плазматической мембраны нейтрофилов, поставляя в нее рецепторные белки, ферменты или компоненты ферментных комплексов, входившие в состав мембран гранул или находившиеся на их поверхности. В результате слияния мембран гранул и цитоплазматической мембраны площадь клеточной поверхности может значительно увеличиваться, способствуя распластыванию клеток на субстрате, т.е. увеличению их среднего диаметра. Согласно экспериментальным данным, площадь клеточной поверхности во вре-
мя направленной миграции клеток может увеличиваться на 20—30% [2]. Наличие многочисленных, но небольших псевдоподий у неактивных нейтрофилов не объясняет столь значительные изменения площади поверхности клеток. В организме "ступенчатый" экзоцитоз обеспечивает последовательность процессов адгезии нейтро-филов к эндотелию, их прохождения между клетками эндотелия, хемотаксиса к месту инфицирования, фагоцитоза и уничтожения патогенных микроорганизмов.
Актиновые элементы цитоскелета играют одну из основных ролей в процессах экзо- и эндоцито-за [1, 3—6]. В различных структурных состояниях (полимеризованном и деполимеризованном) ак-тиновый цитоскелет может как ингибировать, так и активировать экзо- и эндоцитоз. Кортикальный цитоскелет может служить барьером для слияния гранул с плазматической мембраной и участвовать в подавлении передачи сигналов, инициирующих экзоцитоз. В этом случае разрушение акти-новых филаментов способствует экзоцитозу, что было экспериментально показано при использовании цитохалазинов и латрункулина — агентов, разрушающих эти структуры цитоскелета [1]. В других случаях актиновый цитоскелет ускоряет процессы слияния гранул и способствует экзоци-тозу. Известно, что количество актиновых фила-ментов, связанных с различными гранулами ней-трофилов, различно. Если количество актина, связанного с плазматической мембраной клетки, принять условно за 100%, то больше всего актина (75%) связано с секреторными пузырьками, 40% актина находится в связанном с желатиназными гранулами состоянии, 10% — со специфическими, а 5% — с азурофильными гранулами [1]. Установлено, что для экзоцитоза гранул нейтрофилов важно установление определенного соотношения между процессами деполимеризации и полимеризации актина, контролируемыми G-белками и ионами Са2+, причем для гранул разного типа это соотношение различно [7].
Пероксинитрит (ОМОО) — один из продуктов респираторного взрыва фагоцитов. Пероксинит-рит синтезируется в реакции монооксида азота с супероксид-анион-радикалом и характеризуется высокой реакционной способностью по отношению к белкам, липидам и нуклеиновым кислотам. Пероксинитрит способен модифицировать структуру мембран и кортикального цитоскелета, изменяя функции этих структурных элементов клетки и пути проведения сигнала в нейтрофилах [8]. Нами обнаружена активация пероксинитри-том респираторного взрыва нейтрофилов, а также ускорение процесса распластывания нейтрофи-лов на субстрате [9].
Целью настоящего исследования являлось изучение с помощью методов проточной цито-
флуориметрии, световой и атомно-силовой (АСМ) микроскопии процессов регуляции пе-роксинитритом распластывания нейтрофилов на субстрате (поверхности предметного стекла) и экзоцитоза их внутриклеточных гранул, а также механизмов участия актинового цитоскелета в пе-роксинитрит-индуцированном экзоцитозе внутриклеточных гранул.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Реактивы. Использовали урографин (Schering AG, Германия), гепарин, смесь азур-эозина и 30% H2O2 (Белмедпрепараты, Беларусь). Остальные реактивы были производства Sigma или Aldrich.
Выделение нейтрофилов, обработка нейтрофилов пероксинитритом и подготовка клеток для АСМ. Нейтрофилы выделяли из периферической крови здоровых доноров по методу, описанному в работе [10]. Венозную гепаринизированную кровь инкубировали в присутствии декстрана Т-500 (Fluka Chemie, Швейцария). Взвесь клеток над слоем осевших эритроцитов разделяли в градиенте плотности фиколл — урографин. Примесь эритроцитов удаляли при помощи осмотического шока в холодной дистиллированной воде. Клетки ресуспендировали в фосфатном буфере (60 мМ Na2HPO4/NaH2PO4, 83 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ CaCl2, pH 7.4). Содержание нейтрофилов в суспензии клеток было не менее 95%.
Пероксинитрит получали в реакции NaNO2 и H2O2 в кислых водных растворах с последующим быстрым их защелачиванием [11]. Для этого 100 мл 1.2 М NaNO2 быстро смешивали со 100 мл раствора Н2О2 (10 мл 30% H2O2, 60 мл 1 M HNO3, 30 мл H2O) и к полученной смеси добавляли 100 мл 1.5 М NaOH. Избыток H2O2 удаляли фильтрацией раствора пероксинитрита через гранулированный MnO2. Раствор пероксинитрита замораживали и хранили при температуре —20°С в течение 3—7 дней, затем его верхний (желтый) слой использовали в качестве рабочего раствора. Концентрацию пероксинитрита определяли спектро-фотометрически (s302 = 1670 см-1 М-1). Нейтро-филы обрабатывали пероксинитритом в различных концентрациях — от 1 мкМ до 1 мМ в течение 10 мин (опытные образцы). Контрольными образцами служили суспензии нейтрофилов без какой-либо обработки или клеточные суспензии, обработанные водным раствором 0.5 М NaOH в объеме, соответствующем объему пероксинитрита в опытных образцах. Затем клетки наносили на обезжиренную стеклянную поверхность, инкубировали в течение 5—180 мин, не допуская высушивания образцов. После этого клетки фиксировали 1% раствором глутарового альдегида в течение 30 мин, отмывали буферным раствором и дистиллированной водой и высушивали при комнатной температуре. Морфологический анализ
клеточной популяции проводили с помощью световой микроскопии (окраска по Романовскому— Гимзе). Данные световой микроскопии обрабатывали с помощью программы ImageJ 1.39 (NIH, США).
АСМклеток крови и анализ данных АСМ. АСМ
проводили в контактном режиме сканирования с использованием зондов типа CSC38 (MicroMash, Россия) на атомно-силовом микроскопе НТ-206 (МикроТестМашины, Беларусь). Регистрировали топографию и карты латеральных сил (боковые отклонения конца консоли в месте расположения острия иглы-зонда) поверхности клеток. Для количественной оценки структуры клеточной поверхности был проведен фрактальный анализ карт латеральных сил площадью 1 мкм х 1 мкм. Карта латеральных сил участка поверхности клетки является "измятой поверхностью", характеризующей пространственное распределение структурных и механических свойств участка клеточной поверхности [8]. Если топологическую размерность DT используют для характеристики объектов, которые моделируются т
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.