ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 5, с. 499-504
УДК 577.29;577.112;577.152
ПЕРСПЕКТИВЫ ПРАКТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ СУБСТРАТСВЯЗЫВАЮЩИХ МОДУЛЕЙ ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗ
(ОБЗОР)
© 2004 г. И. Ю Волков, Н. А Лунина, Г. А. Великодворская
Институт молекулярной генетики РАН, Москва, 123182; e-mail: velik@img.ras.ru Поступила в редакцию 25.12.2003 г.
В обзоре рассмотрены свойства субстратсвязывающих модулей гликозилгидролаз. Благодаря вариабельности свойств использование модулей в составе химерных белков - перспективная и быстро развивающаяся область биотехнологии. Описаны примеры использования субстратсвязывающих модулей гликозилгидролаз для иммобилизации белков и целых клеток на полисахаридах, очистки белков. Кратко изложены также перспективные методы детекции соединений с помощью гибридов субстратсвязывающих модулей с антителами, определения локализации полисахаридов в живых тканях и другие.
Гликозилгидролазы - ферменты, гидролизую-щие гликозидные связи в олиго- и полисахаридах. Гликозилгидролазы, действующие на сложные высокополимерные субстраты, как правило, имеют мультидоменную структуру и состоят из функционально и пространственно обособленных глобулярных доменов, называемых модулями. При разделении таких модулей их пространственная структура и функции обычно сохраняются. Субстратсвязывающие модули (ССМ) гликозилгидролаз - это домены, специфически связывающиеся с олиго- и полисахаридами, например с целлюлозой, хитином, ксиланом, Р-(1,3)-глюканами [1-10]. Наиболее изученными на сегодня являются цел-люлозосвязывающие модули (ЦСМ).
В структуре целлюлозы из растительных источников присутствуют кристаллические (плот-ноупакованные) и аморфные (разрыхленные) участки [11]. Структура некоторых других природных полисахаридов также гетерогенна. Глю-каны клеточных стенок микроорганизмов, например Р-(1,3)-глюкан клеточной стенки дрожжей [12], а также некоторых растений (целлюлоза клеточной стенки водорослей Уа1ота [13], целлюлоза клеточной стенки хлопчатника [14]), обычно высококристаллические. Большинство менее высокомолекулярных полисахаридов - аморфные. Соответственно ССМ разделяются на специфичные в отношении кристаллических и специфичные в отношении аморфных участков волокна.
Большинство ферментов, содержащих ССМ, обнаружено у микроорганизмов. Различные ССМ содержат от 40 до 200 и более аминокислотных остатков и имеют молекулярную массу от 5 до 25 кДа. Широко варьируют также их физико-химические свойства. В частности, некоторые ССМ высоко термостабильны как в составе ис-
ходного белка, так и в виде отдельной белковой молекулы [9].
ССМ с близкими аминокислотными последовательностями были объединены в семейства по тому же принципу, который ранее применен для классификации каталитических доменов гликозилгидролаз [15, 16]. В настоящее время известно 32 семейства ССМ [17].
Для третичной структуры большинства семейств ССМ характерно наличие Р-слоевых участков. Все домены в пределах одного семейства имеют близкое пространственное строение белковой глобулы и соответственно ССМ одного семейства специфичны в большей степени либо к аморфным, либо к кристаллическим участкам полисахарида. Исключением из этого правила является многочисленное семейство 4. В это семейство входят целлюлозосвязывающие модули (ЦСМ), специфичные как к аморфным [4], так и к кристаллическим участкам целлюлозы [18], а также Р-(1,3)-глюканспецифичные ССМ [9]. Филогенетический анализ позволил разделить семейство 4 на 4 подсемейства [9]. В пределах каждого подсемейства наблюдается одинаковая специфичность. Представители различных подсемейств обладают сходными принципами построения белковой глобулы, однако их конкретная пространственная структура заметно отличается.
Сравнительное изучение некоторых трехмерных структур ССМ позволило выявить два основных типа их строения: в первом случае белковая глобула обладает протяженным участком плоской поверхности, во втором - субстратсвязываю-щим желобком (ложбиной) [19-23]. Как правило, ССМ с участком плоской поверхности специфичен по отношению к кристаллическим участкам волокна, во втором - к аморфным. В обоих случа-
Рис. 1. Зависимость количества адсорбировавшегося белка [В] от концентрации свободного белка в
пробе [Б].
ях взаимодействия отмечено существенное значение гидрофобных остатков [20, 24-26] (в частности, остатков триптофана [27]), водородных связей и Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий [28-30]. Необходимость стерического соответствия формы молекулы ССМ и конкретной структуры по-лисахаридного волокна легко объясняет смысл существования двух типов трехмерной структуры, поскольку для связывания с кристаллическими участками, состоящими из множества плотно уложенных цепей полисахарида, необходима плоская поверхность, а для связывания с аморфными участками полисахарида необходим желобок или ложбина, соответствующие по форме и размеру отдельным цепям полисахаридного волокна.
По существующим представлениям, значение ССМ для функционирования гликозилгидролаз состоит в увеличении локальной концентрации молекул фермента вблизи субстрата за счет связывания с ним [31]. Кроме того, в некоторых случаях предполагается модифицирующее действие ССМ на волокна полисахаридов, в частности, некоторые ЦСМ переводят в раствор частицы микрокристаллической целлюлозы [32, 33].
Для различных типов ССМ сила связывания с субстратом широко варьирует [34, 35] - от необратимой сорбции до относительно слабого взаимодействия. Большинство ССМ десорбируются с полисахаридного волокна при резком изменении рН или ионной силы, с помощью растворимых олиго-сахаридов или детергентов. Однако некоторые ССМ могут быть сняты с субстрата только после их денатурации, поэтому большое значение для изучения возможности практического использования ССМ имеет определение силы связывания (сродства к субстрату), устойчивости связывания к действию физических и химических агентов, а также условия осуществления их десорбции.
Степень связывания ССМ с полисахаридами может быть охарактеризована двумя величинами: константой диссоциации Ка или обратной ей величиной Ка (константа аффинности Ка = 1/К), а также максимальной емкостью Л0. Согласно теоретическим представлениям, зависимость количества адсорбированного белка [В] от концентрации его в пробе в свободном виде [Б] имеет вид [В] = [Б]Лу([Б] + К) (рис. 1). При бесконечной концентрации свободного белка значение [В] стремится к Л0. Константа диссоциации Кл характеризует сродство или силу взаимодействия ССМ, а Л0 указывает на максимальное количество сайтов возможной посадки данного ССМ на конкретном полисахариде. На рис. 1 для кривой 1 сродство (сила связывания) высокое, значение Кл низкое, а для кривой 2 - наоборот, значение Кл высокое, а сродство - низкое. Большинство ССМ, специфично связывающихся с кристаллическими участками, также способны связываться (с меньшей силой) с аморфными участками волокна. Однако ЦСМ, специфичные в отношении аморфных участков волокна, практически не сорбируются на кристаллических формах целлюлозы. В отличие от аморфных, неупорядоченных кристаллические участки целлюлозного волокна плотно упакованы, их внутренний объем недоступен для крупных молекул (например, белков). Кроме того, показано, что ЦСМ семейства 1 и 3 связываются не со всеми, а только с определенными поверхностями микрофибрилл высококристаллической целлюлозы [36]. Такие гидрофобные поверхности расположены на скругленных углах крупных микрофибрилл целлюлозы из водоросли Уа1ота. Это объясняет гораздо меньшую (обычно на порядок) максимальную емкость адсорбции Л0 на кристаллической целлюлозе, по сравнению с аморфной. Однако ССМ, специфичные в отношении кристаллических участков, обычно связываются с ними гораздо более прочно (значение Ка выше), чем ССМ, специфичные к аморфным, с аморфными участками волокна. Поскольку произведение величин Л0 и Ка в этих случаях более или менее постоянно, некоторые авторы используют величину относительной аффинности Кг = = Л0Ка для исследования специфичности ССМ в отношении различных структурных форм волокна. Специфичность отдельных ЦСМ в отношении форм целлюлозы с разной степенью кристалличности отражена в таблице [3, 4, 18, 37]. В структуре аморфной целлюлозы, полученной разрыхлением фосфорной кислотой, представлены почти исключительно аморфные участки. Бактериальная микрокристаллическая целлюлоза - сильноупо-рядоченный высококристаллический субстрат, а целлюлоза типа "Авицел" представляет собой смешанный тип с преобладанием кристаллических участков.
Специфичность некоторых ЦСМ в отношении различных форм целлюлозы
ЦСМ Семейст- Аморфная целлюлоза "Авицел" Бактериальная целлюлоза
во Kr, л/г N0, мкмоль/г Kr, л/г N0, мкмоль/г Kr, л/г N0, моль/г
CelK [18] Clostridium thermocellum 4 2.33 16 9.87 4
N1 CenC [4] Cellulomonas fimi 4 5.05 0.24 нсв* нсв*
CipA [3] Clostridium thermocellum 3 1.35 0.56
Cex [4] Cellulomonas fimi 2 1.5 2.7 20.8
CenA [37] Cellulomonas fimi 2 45.3
* нсв - связывание слишком слабое для проведения корректных измерений.
Строение природного целлюлозного волокна весьма сложно и само разделение на аморфные и кристаллические участки волокна достаточно условно [38]. Поэтому более правильно говорить о специфичности ЦСМ, как о предпочтении тех или иных разнообразных структурных участков целлюлозы. Приведенные в таблице значения показывают, что ЦСМ N1 CenC Cellulomonas fimi специфичен к аморфным участкам, а ЦСМ CelK и CipA Clostridium thermocellum, а также Cex и CenA C. fimi специфичны к кристаллическим участкам. Следует отметить, что значение относительных аффинностей Kr к различным формам целлюлозного волокна существенно варьирует для ЦСМ, специфичных к кристаллическим формам целлюлозы. Большая вариабельность свойств ССМ (в том числе ЦСМ) позволяет использовать их для решения широкого круга практических задач.
Современный этап молекулярно-биологичес-ких исследований характеризуется стремительным развитием методов и средств инженерии белковых молекул, анализа белковых структур, а также накоплением знаний о конкретных белковых молекулах и функцио
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.