Ветеринария и Зоотехния
Диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных
Вологжанина Н.В., аспирант Слесаренко Н.А., доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой, декан, заслуженный деятель науки Российской Федерации (Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина) Ставицкий С.Б., кандидат биологических наук
Еремин И.И., кандидат медицинских наук
(Центр ветеринарной клеточной медицины, г. Москва)
ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ
В ВЕТЕРИНАРНОЙ ОФТАЛЬМОЛОГИИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)
Представлены результаты эксперимента на моделях язвы роговицы у кроликов. Предпринята попытка применить гемопоэтические стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани и лимбальные стволовые клетки путём введения суспензированной взвеси клеток инстил-ляционно, интростромально и субконъюнктивально с целью выявления их пролиферативных свойств. Исследования направлены на выяснение механизмов регуляции процессов дифференцировки стволовых клеток после трансплантации их на поверхность глаза.
Ключевые слова: ветеринарная офтальмология, стволовые клетки, роговица глаза, регенеративная терапия.
PROSPECTS OF USING STEM CELLS OF VARIOUS TYPES IN VETERINARY OPHTHALMOLOGY (EXPERIMENTAL STUDY)
The results of experiments on models of corneal ulcer in rabbits. An attempt was made concerning using hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells of adipose tissue and limbal stem cells by means of injecting the cell suspension instillationally, intrastromally and subconjunctivally in order to identify their prolif-erative properties. The studies are aimed at identifying the mechanisms of regulation of the processes of stem cells differentiation, after their transplantation on the ocular surface.
Keywords: veterinary ophthalmology, stem cells, eye cornea, regenerative therapy.
Актуальность проблемы
Лечение животных с заболеваниями и повреждениями роговицы глаза, при которых имеется выраженная несостоятельность процессов регенерации, приводящая в исходе к значительному снижению остроты зрения и слепоте, остается актуальной проблемой ветеринарной офтальмологии. [1-5]
В настоящее время, ведется поиск эффективных способов, которые позволили бы успешно лечить повреждения роговицы различной этиологии. В эксперименте на моделях язвы роговицы у кроликов нами предпринята попытка применить гемопоэтические стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани и лимбальные стволовые клетки,
путём введения суспензированной взвеси клеток инстилляционно, интростромально и суб-конъюнктивально, с целью выявления их пролиферативных свойств.
Цель настоящего экспериментального исследования заключалась в выявлении особенности заживления моделированной язвы роговицы у кроликов при использовании разных типов стволовых клеток.
Для достижения поставленной цели было необходимо решение ряда конкретных задач:
В условиях моделированной язвы роговицы у кролика выявить пролиферативные потенциалы стволовых клеток следующих типов:
1. Аутологичных гемопоэтических;
2. Гомологичных СК лимба;
3. Аутологичных СК лимба;
4. Гомологичных мезенхимальных клеток жировой ткани;
5. Аутологичных мезенхимальных клеток жировой ткани.
Провести сравнительный анализ индукции заживления поврежденного эпителия роговицы между стволовыми клетками указанных типов;
На основании клинико-морфологических данных, определить тип стволовых клеток, оптимальный по регенераторным свойствам
Материал и методы исследования
Объектом исследования являлись 30 кроликов (60 глаз) породы Серый великан, массой 2,7 - 3,0 кг, в возрасте от 8 до 10 месяцев.
Использовали комплексный, методический подход, включающий экспериментальное моделирование повреждения роговицы, основные моменты операции послойной кератоэк-томии осуществляли по общепринятой методике, описанной Дроновым, офтальмическое обследование зоны повреждения, морфологические методы исследования и статистический анализ по полученным цифровым данным.
Животные были подразделены на 6 групп. Каждой группе соответствовал исследуемый тип клеток. Культуры клеток исследовали на стерильность, острую токсичность и пироген-ность. Перед трансплантацией суспензию клеток тщательно отмывали от культуральной среды, подсчитывали количество жизнеспособных клеток и суспензировали в минимальном количестве физиологического раствора.
В опытных группах производили субконъюнктивальную инъекцию суспензии стволовых клеток в 0,2 мл физиологического раствора. У контрольных животных в аналогичные сегменты роговицы вводили то же количество физиологического раствора (Натрия Хлорид 0,9 %) для возникновения идентичной реакции тканей роговицы на интрастромальное повреждение.
Клинические методы исследования включали осмотр переднего отрезка глаз с помощью фокального и бокового освещения и биомикроскопию щелевой лампой фирмы «Shin» с флюоресцеиновой пробой и фоторегистрацией. Оценку состояния глаз проводили на 7 и 14 сутки после трансплантации по следующим признакам: степени выраженности воспалительной реакции, диаметру дефекта эпителия, интенсивности помутнения роговицы.Степень выраженности воспалительной реакции оценивали по балльной системе Ченцовой Е.В. Площадь дефекта стромы роговицы определяли с помощью биомикроскопии. Интенсивность помутнения роговицы оценивали по шкале Войно-Ясенецкого.
На 15 день исследования животным была проведена энуклеация глазных яблок с целью выявления морфофункциональных изменений в роговице после трансплантации стволовых клеток.
Результаты исследования
Результаты применения аутологичных гемопоэтических стволовых клеток. Данные гистологического исследования роговицы кролика на 14 сутки после введения ауто-ГСК показали, что эпителий равномерно покрывал всю поверхность роговицы, присутствовал незначительный дефект на границе нормальной и трепанационной зоны. Так же, наблюдали изменение количественного представительства слоёв эпителия до 3-4, при норме 5-6. В центральной области зоны дефекта отмечали скопление фибробластоподобных клеток.
Результаты применения гомологичных стволовых клеток лимба. Анализ динамики морфологических изменений в ткани роговицы после введения гомологичных стволовых клеток лимба на 14 сутки показал утолщение эпителиального регенерата в краевых и центральных зонах повреждения за счет увеличения количества слоёв до 5-9. Субэпителиально наблюдали макрофагально-фибробластическую инфильтрацию и наличие крупных фиброб-ластов с обширной цитоплазмой. Эта картина соответствует активному заживлению дефекта роговицы.
Результаты применения аутологичных стволовых клеток лимба. При оценке микрокартины заживления на 14 сутки после введения аутологичных лимбальных стволовых клеток количество слоев клеток поверхностного эпителия возрастало до 5-8, незначительная макрофагально-фибробластическая инфильтрация сохранялась и увеличивалась биосинтези-рующая активность фибробластов, что подтверждается их структурно-функциональным состоянием.
Результаты применения гомологичных мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани. Структурное состояние роговицы глаза после введения гомологичных мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани в динамике регенераторного процесса показало, что на 7 сутки дефект полностью эпителизирован. Эпителиальный пласт состоял из 1-2 слоёв уплощенных эпителиоцитов. На 14 сутки количество эпителиальных слоёв увеличилось до 4-5, клетки приобретали кубическую форму. В строме наблюдали фибробластическую инфильтрацию.
Результаты применения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани. Структурное состояние роговицы глаза после введения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани характеризовалось равномерным покрытием всей поверхности роговицы эпителием, вместе с тем, выявлено четкое подразделение границы трепанационной зоны. Количество слоев эпителия на 14 сутки составляло от 7 до 2 от периферии к центру, соответственно. В строме наблюдали признаки склероза волокнистых конструкций.
У контрольных животных на 7 сутки эпителизацию дефекта наблюдали лишь в 20 % случаев. Признаки регенерации эпителиального пласта выявлены лишь по периферии зоны повреждения. В строме присутствовали выраженный отёк и макрофагально-фиброблас-тическая инфильтрация с увеличением количества активных фибробластов. На 14 сутки дефект уже эпителизирован у всех особей контрольной группы. Однако эпителиальный пласт истончен и представлен всего 2-3 слоями клеток. В строме отмечали признаки склероза. По краям дефекта сохранялась макрофагальная инфильтрация, при этом явление отёка было более ярко выражено, чем у животных всех опытных групп.
Сравнительный анализ регенераторного влияния разных типов стволовых клеток показал, что эпителизация зоны дефекта роговицы у животных после введения жировых СК происходила активнее и в более короткие сроки в сравнении с животными, которым вводили ау-тологичные лимбальные стволовые клетки. Лидером по скорости эпителизации дефекта и количественного представительства эпителиальных слоёв явились особи, которым вводили гомологичные стволовые клетки лимба.
На сегодняшний момент, наши исследования направлены на выяснение тонких механизмов регуляции процессов дифференцировки стволовых клеток, после трансплантации
их на поверхность глаза. После подтверждения эффективности и безопасности нового метода лечения станет возможным его применение у пациентов с тяжелыми заболеваниями и повреждениями глаз, ранее неизбежно приводивших к значительному снижению зрения и слепоте.
Выводы
1. Показана возможность использования разных типов стволовых клеток в ветеринарной офтальмологии для лечебной коррекции повреждений роговицы, что подтверждается ее кли-нико-морфологическими характеристиками у подопытных животных.
2. В экспериментальный период наблюдений у животных, подвергшихся регенеративной терапии стволовыми клетками, отсутствовала неоваскуляризация роговицы, воспалительная реакция на травму была менее выражена, чем в контроле, активно протекали пролиферат
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.