МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2009, том 43, № 6, с. 984-998
== ОБЗОРЫ :
УДК 577.218
ПЕРСПЕКТИВЫ ТЕХНОЛОГИЙ АНТИСМЫСЛОВОЙ ТЕРАПИИ
© 2009 г. М. Ю. Скоблов
Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук, Москва, 115478
Поступила в редакцию 22.01.2009 г. Принята к печати 11.02.2009 г.
В настоящее время известно три варианта антисмысловых технологий: антисмысловые олигонуклеотиды, РНК-интерференция и рибозимы. Несмотря на различные механизмы работы, их всех объединяет общий принцип: антисмысловой препарат работает после связывания с РНК-мишенью с образованием дуплекса. Все три варианта сегодня активно используются в экспериментах in vivo. В данном обзоре рассмотрено современное состояние дел в области применения антисмысловых технологий в терапии различных заболеваний.
Ключевые слова: антисмысловая терапия, антисмысловые олигонуклеотиды, РНК-интерференция, рибозимы.
PROSPECTS OF ANTISENSE THERAPY TECHNOLOGIES, by M. Yu. Skoblov* (Research Center for Medical Genetics, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, 115478 Russia; *e-mail: mskoblov@generesearch.ru). Up-to now three variants of antisense technologies are known, namely antisense oligonucleotides, RNA interference, and ribozymes. In spite of different mechanisms of action, all of them are united by the common principle: an antisense preparation works after binding with RNA-target by forming a duplex. Today all three variants are intensively used in vivo. Present posture of affairs in use of antisense technologies for treating various diseases is considered in the review.
Key words: antisense therapy, antisense oligonucleotides, RNA interference, ribozymes.
Причина большинства хронических заболеваний человека - недостаточное или избыточное производство того или иного белка в клетке. Стратегия лечения заболеваний, связанных с недостаточным уровнем белка, предусматривает коррекцию уровня его синтеза либо путем прямого введения этого белка в организм, как, например, инсулина, либо восстановлением экспрессии поврежденного гена с помощью перспективного, но пока недостаточно безопасного метода генной терапии. В настоящее время для подавления избыточного производства белка, в основном, используют широкий спектр фармпрепаратов, однако постепенно внедряются и ген-специфические технологии.
Первые эксперименты по подавлению экспрессии генов с использованием антисмысловой технологии проведены более 30 лет назад. Бурный расцвет технологии антисмысловых олигонуклеотидов
Принятые сокращения: PHKi - РНК-интерференция; miPHK (micro RNA) - микро-РНК; siPHK (small interference RNA) -малые интерферирующие РНК; ACOH - антисмысловыге олигонуклеотиды; ВИЧ - вирус иммунодефицита человека; ВМД - возрастная макулярная дегенерация; ЦМВ - цитоме-галовирус; RISK (RNA-induced silencing complex) -индуцируемый РНК комплекс сайленсинга.
* Эл. почта: mskoblov@generesearch.ru
(АСОН) пришелся на 80-е годы, но к середине 90-х интерес к ней угас, так как АСОН плохо проникали в клетку и были неустойчивы к действию нуклеаз. Чтобы устранить эти проблемы, проводили многочисленные химические модификации АСОН, которые и легли в основу разработок большинства современных антисмысловых препаратов.
Альтернатива АСОН - использование новой технологии малых интерферирующих РНК (яРНК), основанной на механизмах РНК-интерференции (РНКТ). Открытие РНК1 и ее дальнейшее изучение на протяжении 10 лет привело к революции в биологии вообще и в молекулярной генетике в частности. Главное преимущество использования технологии 81РНК - эффективность, которая примерно на 2 порядка выше, чем для АСОН [1]. Однако неустойчивость к действию РНКаз и отсутствие методов эффективной доставки - это те факторы, которые препятствуют внедрению 81РНК-техноло-гии в клинику. Большинство усовершенствований в технологии 81РНК базируется на разработках, относящихся к АСОН. В настоящее время непонятно, вытеснит ли 81РНК-технология АСОН, или же эти два подхода будут развиваться параллельно.
Рибозимы были открыты сразу же за АСОН. Но, несмотря на значительные успехи в развитии технологии рибозимов, она распространена гораздо меньше АСОН и 81РНК. Это связано с тем, что даже для крупных компаний гораздо доступнее использование технологий АСОН и 81РНК, чем рибозимов. Тем не менее, технология рибозимов продолжает развиваться и дает хорошие результаты.
АНТИСМЫСЛОВЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ
Впервые антисмысловая технология описана в 1977 г., когда показали, что одноцепочечный фрагмент ДНК ингибирует трансляцию мРНК в бесклеточной системе [2]. Следующая работа, проведенная в 1978 г. Замецником и Стефенсоном [3], открыла эру антисмысловой терапии в живых клетках. 13-членный синтетический олигонуклео-тид, комплементарный 3'- и 5'-концевым последовательностям 358 РНК вируса саркомы Рауса, введенный в культуру куриных фибробластов, зараженных этим вирусом, подавлял инфекционный процесс и предотвращал трансформацию фибробластов в клетки саркомы. Так впервые показали, что АСОН могут специфично ингибировать экспрессию генов.
В течение нескольких последующих лет прогресса в области АСОН не наблюдалось, что вполне объяснимо: во-первых, автоматический синтез олигонуклеотидов находился тогда только на стадии разработки, и, во-вторых, информация о нук-леотидных последовательностях генов человека практически отсутствовала.
К середине 1980-х гг. опубликован ряд работ, в которых показано существование природных антисмысловых транскриптов и доказана их роль в регуляции экспрессии генов эукариот [4, 5, 6]. Эти работы подтверждали идею о том, что АСОН могут управлять экспрессией генов в живых клетках. В дальнейшем усовершенствование методов анализа нуклеотидных последовательностей ДНК и синтеза олигонуклеотидов стали основой бурного развития технологии АСОН. По сравнению с традиционными фармакологическими подходами преимущества АСОН стали очевидны: избирательное связывание с внутриклеточными мишенями, устойчивость и длительность действия в клетке (около недели), быстрое проявление эффекта (в течение нескольких часов). Кроме того, АСОН легко подвергаются биодеградации и удаляются из организма, а их синтез прост и доступен.
Химия АСОН
Требования к современным АСОН включают следующие условия: 1) устойчивость к деградации нуклеазами; 2) высокое сродство к комплементарной им мРНК; 3) высокая специфичность связывания с комплементарной РНК; 4) способность акти-
вировать РНКазу H, разрушающую РНК-цепь в составе АСОН-мРНК дуплекса; 5) эффективность проникновения в клетку; 6) хорошие фармакокине-тические и фармакодинамические свойства.
Немодифицированные олигонуклеотиды плохо проникают через клеточную мембрану, а вне и внутри клеток они быстро деградируют в результате действия экзо- и эндонуклеаз [7, 8]. С целью придать АСОН устойчивость к эндонуклеазам проводят химические модификации рибозы, азотистых оснований и фосфатной группы. Однако многие из этих модификаций ведут к нежелательным последствиям, в частности, снижают эффективность проникновения АСОН в клетку или расщепления дуплекса мРНК-АСОН.
Первое поколение АСОН проявляло устойчивость к нуклеазам, что обусловлено модификацией фосфодиэфирной связи: замещение кислорода на серу (фосфотиоаты), метильную группу (метил-фосфанаты) или амин (фосфорамидиты). Фосфо-тиоатные олигонуклеотиды оказались весьма эффективными, поскольку обладали устойчивостью к нуклеазам и хорошими фармакокинетическими свойствами, они активировали нуклеазу Н, а их синтез не представлял трудностей. В то же время эти АСОН плохо связывали целевые последовательности, недостаточно эффективно проникали в клетку, и спектр их распределения по органам и тканям оставлял желать лучшего [9]. Несмотря на это, исследование фосфотиоатных олигонуклеотидов в экспериментальных моделях многих заболеваний как in vitro, так и in vivo дало хорошие результаты [10]. Первый одобренный антисмысловой препарат витравен (vitravene, fomivirsen), предназначенный для лечения воспаления сетчатки, вызываемого цитомегаловирусом (ЦМВ) у больных СПИДом, а также большинство АСОН, находящихся в настоящее время на стадии клинических испытаний, представляют собой именно фосфо-тиоаты.
АСОН второго поколения модифицированы по 2' положению рибозы путем введения 2'-0-метиль-ной, 2'-0-метоксиэтильной или аминопропильной группы [11]. Эти модификации приводят к снижению токсичности АСОН и увеличивают стабильность гибридного дуплекса, а также обусловливают их устойчивость к нуклеазам. Однако модифицированные таким образом олигонуклеотиды образуют с мРНК не расщепляемые РНКазой Н дуплексы. В то же время комбинация модификаций, в результате которой при сохранении фосфотиоатного дезок-сирибозного ядра на концах олигонуклеотида оказываются 2'-0-метильные рибонуклеозиды, оказалась успешной [12, 13]. Такая комбинация лежит в основе препарата GEM231 - 18-членного антисмыслового олигонуклеотида, подавляющего протеин-киназу А. Этот препарат уже прошел I и II фазы
клинических испытаний в качестве средства для лечения солидных опухолей [14].
Наиболее интересные представители третьего поколения антисмысловых агентов - пептидные нуклеиновые кислоты, морфолино-фосфорамиди-ты и замкнутые нуклеиновые кислоты. Все они устойчивы к действию нуклеаз и хорошо отжигаются на мРНК-мишени. Однако электростатическая нейтральность препятствует их свободному проникновению в клетку. Проблема может быть решена присоединением к таким АСОН определенных лигандов (например, остатков лизина). На основе морфолино-фосфорамидитов разработаны хорошие терапевтические препараты, в частности, уже прошедший I и II фазы клинических испытаний AVI-4126 - антисмысловой олигонуклеотид к онкогену c-myc [15].
Механизм действия
После проникновения в клетку антисмысловой олигонуклеотид гибридизуется на мРНК-мишени или геномной ДНК, что может привести к разрушению РНК и/или подавлению транскрипции, сплайсинга, трансляции. Разрушение мРНК, связанной с АСОН, осуществляется рибонуклеазой H, нормальной функцией которой является удаление РНК-затравок во время движения репликативной вилки. Создав стерическое препятств
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.