ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 5, с. 666-673
УДК 581.1
ПИГМЕНТЫ И ОСОБЕННОСТИ ГАЗООБМЕНА В ЛИСТЬЯХ ХЛОРОФИЛЛЬНЫХ МУТАНТОВ Pisum sativum
© 2004 г. В. Г. Ладыгин, А. А. Кособрюхов, О. Б. Вайшля*
Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук, Пущино Московской обл.; * Биолого-почвенный факультет Томского государственного университета, Томск
Поступила в редакцию 20.03.2004 г.
Исследовали количественный и качественный состав пигментов и газообмен хлорофильных мутантов гороха Pisum sativum L. - chlorotica 2004 и 2014. Мутант 2004 имеет светло-зеленую, а мутант 2014 - желто-зеленую окраску листьев и стебля и содержат, соответственно, около 80 и 50% хлоро-филлов от исходной формы гороха сорта Торсдаг. В составе каротиноидов у мутанта 2004 значительно снижено содержание каротина и увеличено накопление лютеина и виолаксантина. У мутанта 2014 отмечено почти пропорциональное снижение содержания хлорофилла и всех каротиноидов. Квантовая эффективность фотосинтеза у мутантов была на 29-30% ниже, а у гибридов F1 - в 1.52 раза выше по сравнению с контролем. Полученные нами результаты позволяют сделать вывод о том, что нарушение фотосинтеза у мутанта 2014 обусловлено изменением мезоструктуры листьев, а у мутанта 2004 связано, по-видимому, с нарушением реакционных центров фотосистем.
Pisum sativum - мутанты - сЫогойеа - хлорофилл - каротиноиды - фотосинтез - дыхание - хло-ропласты
Пигментные мутанты высших растений и зеленых водорослей являются удобными модельными объектами для исследования физиологических параметров, биосинтеза хлорофиллов и каротиноидов, организации фотосинтетического аппарата растений и генетических исследований хлоропластов [1]. Мутанты гороха типа сЫогойса 2004 и 2014 отличаются от исходной формы изменениями в содержании пигментов, окраски листьев соответственно на светло- или желто-зеленую [2-4], ослаблением роста, низкой продуктивностью (15 и 70%) [5-6] и рядом других показателей. Интересно, что при скрещивании этих мутантов с исходным сортом Торсдаг гибриды первого поколения (Б1) от сЫогойса 2004 дают гетерозисный эффект по урожайности, а гибриды от сЫогоиса 2014 подобными свойствами не обладают [7]. Возникает вопрос, какие физиолого-биохимичес-кие параметры мутантов сЫогойса 2004 и 2014 обусловливают столь существенные различия? Эти изменения могут быть связаны с мутациями, затрагивающими биосинтез пигментов (и в первую очередь хлорофиллов и каротиноидов), белков пигмент-белковых комплексов, компонентов электрон-транспортной цепи или иных структур-
Адрес для корреспонденции: Ладыгин Владимир Георгиевич. 142290 Пущино Московской обл., Институт фундаментальных проблем биологии РАН. Электронная почта: ladygin@issp.seгpukhov.su
ных компонентов хлоропластов [1, 7-9]. Одним из подходов для выявления структурных и функциональных систем, затронутых мутациями, может являться сравнительный анализ изменения пигментного состава, функциональной активности, структурных и анатомических особенностей сформированных хлоропластов и листьев исходных и мутантных форм растений. Насколько нам известно, подобных физиолого-биохимических исследований на этих перспективных модельных объектах не проводилось.
В связи с изложенным, целью настоящей работы был сравнительный анализ содержания и состава наиболее важных в функциональном отношении пигментов - хлорофиллов и каротиноидов, и особенностей газообмена в листьях гороха исходного сорта Торсдаг, мутантов chlorotica 2004 и 2014 и гибридов первого поколения (F1), полученных от реципрокных скрещиваний исходного сорта и мутантов.
МЕТОДИКА
Объекты. В качестве объектов исследования использовали 20-дневные растения гороха (Pisum sativum L.), сорта Торсдаг и мутантов chlorotica 2004 и 2014. От исходных растений этого сорта Сидоровой [10] в результате замачивания в течение 12 ч воздушно-сухих семян в 0.03%-ном водном растворе этиленимина были индуцированы хлорофильные мутанты типа chlorat^a 2004 и
2014 [3, 11]. Выживаемость после обработки мутагеном составляла 70-80% от контроля [10].
Условия культивирования. Растения гороха выращивали в водной питательной среде [12, с. 28-29] в 5-литровых сосудах. Питательную смесь в сосудах продували воздухом по 15 мин каждые 2 ч круглосуточно. Растения культивировали при 14-часовом фотопериоде в течение 20-22 сут до стадии 5-6 ярусов листьев в климатической камере ШКВ-1 ("МСКБ", Россия) при температуре 25°С и интенсивности светового потока 80 Вт/м2. В опыт брали сформированные листья 3-4 ярусов непосредственно перед экспериментом с 9 до 10 ч утра, чтобы исключить эффект циркадного ритма. При определении содержания пигментов листья 1 ч выдерживали в темноте.
Анализ пигментов. Количественное содержание пигментов определяли спектрофотометриче-ски после растирания листьев в фарфоровой ступке с СаС03 и экстрагирования их 100%-ным ацетоном. Спектры регистрировали на спектрофотометре НИасЫ-557 (Япония). Для расчетов использовали коэффициенты экстинкции, полученные в работе [13].
Качественный состав хлорофиллов и кароти-ноидов анализировали методами бумажной и тонкослойной хроматографии [14-16]. После растирания листьев с СаС03 в ступке получали суммарный экстракт пигментов смесью ацетона и этанола 3 : 1. Хроматографическое разделение хлорофиллов и каротиноидов проводили на бумаге ^N-2 (Германия) или в смеси адсорбентов на стекле [16] размером 20 х 20 см. Элюаты хлорофиллов в ацетоне, каротинов в хлороформе и ксантофиллов в этаноле идентифицировали по спектрам поглощения, полученным на спектрофотометре НИасЫ-557 (Япония). Содержание каждого из пигментов рассчитывали по основному максимуму поглощения: Р-каротина при 464 нм, лютеина - 446 нм, виолаксантина - 442 нм, не-оксантина - 438 нм, хлорофилла Ь - 644 нм и хлорофилла а - 662 нм [15, 17].
Измерение С02-газообмена. С02-газообмен, т.е. фотосинтез и темновое дыхание листьев гороха, измеряли в газометрической системе стационарной экспериментальной установки закрытого типа с инфракрасным газоанализатором Шта-1У-4 ("1ипка1ог", Германия) [18], обеспечивающей диапозон измерений 0-0.1% С02. Для измерения поглощения С02 (фотосинтеза) и выделения С02 (темнового дыхания) листья 3-4 ярусов гороха помещали в герметичную ассимиляционную камеру. 0бразцы освещали лампой ЗН-7 с зеркальным отражателем, через водяной фильтр. Интенсивность освещения на уровне растений была насыщающей и составляла 200 Вт/м2, температура -25 °С. После измерения скорости поглощения С02 свет выключали и через 30 мин измеряли
скорость темнового дыхания. Скорость фотосинтеза и дыхания рассчитывали в мкмолях С02 на мг хлорофилла в ч, а также на дм2 площади и сырую массу листьев [19].
Световые кривые фотосинтеза. Во всех измерениях максимальная интенсивность света составляла 200 Вт/м2 (700 мкмоль/(м2 с)). Различные уровни освещенности листьев в ассимиляционной камере создавали, помещая между камерой и источником света нейтральные светофильтры. Таким образом получали 5 различных уровней интенсивности света: 140, 280, 420, 560 и 700 мкмоль/(м2 с). Интенсивность фотосинтеза определяли после установления стационарной работы фотосинтетического аппарата листьев. Затем свет выключали и определяли скорость дыхания листьев гороха. Анализ световой кривой С02-газообмена проводили по предложенной ранее модели [20, 21], что позволяло по экспериментальным данным рассчитывать фотосинтез при световом насыщении, скорость темнового дыхания, квантовую эффективность фотосинтеза и точки световой компенсации.
Анализ 02-газообмена. Измерение 02-газооб-мена листьев гороха, связанного с выделением 02 в процессе фотосинтеза и поглощением его в процессе темнового дыхания, проводили амперомет-рическим методом с помощью установки, состоящей из полярографа ЬР-7Б (Чехия), самописца и термостатированной ячейки с платиновым электродом Кларка закрытого типа [18].
Анатомия листьев. Число и размеры устьиц определяли с помощью отпечатков поверхности листьев, которые получали, нанося тонкий слой маникюрного лака на среднюю часть листовой пластинки с верхней и нижней стороны. Через 5 мин после подсыхания лаковой пленки ее отделяли от поверхности листа и исследовали под микроскопом при увеличениях в 300-400 раз. Число устьиц определяли при помощи микрометрической сетки или окуляр-микрометра в трех различных точках лакового отпечатка листьев. Для оценки размеров устьиц использовали объект-микрометр.
Устьичный коэффициент (К) рассчитывали по формуле: К = А/(А + В) х 100, где А - число устьиц на единице поверхности листа, В - число эпи-дермальных клеток на той же площади. Полученные данные сравнивали, используя критерии Стьюдента при р > 0.95.
Число клеток паренхимы столбчатой и губчатой ткани листа определяли на цитологических срезах листьев. Для этой цели брали свежесрезанные листья, помещали в разрез сердцевины бузины (БатЬисш racemosa Ь.) и делали срезы с помощью лезвия для безопасной бритвы. Тонкие срезы помещали на предметные стекла в 0.1 М сахарозный буфер рН 7.4, накрывали покровным
Таблица 1. Содержание хлорофиллов и каротиноидов в листьях исходного сорта Торсдаг и мутантов chlorotica 2004 и 2014 Pisum sativum
Варианты Хлорофилл а Хлорофилл b Сумма хлорофиллов Сумма каротиноидов Сумма хлорофилы + + каротиноиды
мг/г сырой массы листьев
Торсдаг 1.35 ± 0.15 0.54 ± 0.06 1.89 ± 0.20 0.59 ± 0.14 2.48 ± 0.16
Мутант 2004 1.03 ± 0.24 0.42 ± 0.06 1.45 ± 0.31 0.49 ± 0.02 1.94 ± 0.14
Мутант 2014 0.75 ± 0.16 0.26 ± 0.07 1.01 ± 0.23 0.31 ± 0.03 1.32 ± 0.11
: Торсдаг х Мутант 2004 1.36 ± 0.09 0.55 ± 0.02 1.91 ± 0.16 0.59 ± 0.12 2.50 ± 0.15
: Мутант 2004 х Торсдаг 1.37 ± 0.17 0.53 ± 0.04 1.90 ± 0.22 0.60 ± 0.11 2.50 ± 0.17
мг/дм2 площади листьев
Торсдаг 4.63 ± 0.45 1.87 ± 0.41 6.50 ± 0.87 1.52 ± 0.49 8.02 ± 0.47
Мутант 2004 3.87 ± 0.34 1.43 ± 0.09 5.30 ± 0.46 1.40 ± 0.28 6.70 ± 0.36
Мутант 2014 2.96 ± 0.36 1.15 ± 0.03 4.11 ± 0.38 0.96 ± 0.21 5.07 ± 0.29
: Торсдаг х Мутант 2004 4.72 ± 0.66 1.88 ± 0.47 6.60 ± 0.82 1.53 ± 0.43 8.13 ± 0.62
: Мутант 2004 х Торсдаг 4.69 ± 0.31 1.78 ± 0.56 6.47 ± 0.87 1.56 ± 0.37 8.03 ± 0.59
Проце
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.