научная статья по теме ПОДАВЛЕНИЕ АВТОКОЛЕБАНИЙ СОКРАТИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПЛАЗМОДИЯ PHYSARUM POLYCEPHALUM ИНГИБИТОРОМ IP3-ЗАВИСИМОГО ВЫСВОБОЖДЕНИЯ СА2+ 2-АМИНОЭТОКСИДИФЕНИЛБОРАТОМ Биология

Текст научной статьи на тему «ПОДАВЛЕНИЕ АВТОКОЛЕБАНИЙ СОКРАТИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПЛАЗМОДИЯ PHYSARUM POLYCEPHALUM ИНГИБИТОРОМ IP3-ЗАВИСИМОГО ВЫСВОБОЖДЕНИЯ СА2+ 2-АМИНОЭТОКСИДИФЕНИЛБОРАТОМ»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2010, том 27, № 1, с. 84-91

УДК 576.321:582.24

ПОДАВЛЕНИЕ АВТОКОЛЕБАНИЙ СОКРАТИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПЛАЗМОДИЯ Physarum polycephalum ИНГИБИТОРОМ ^-ЗАВИСИМОГО ВЫСВОБОЖДЕНИЯ Са2+ 2-АМИНОЭТОКСИДИФЕНИЛБОРАТОМ

© 2010 г. Н. Б. Матвеева, В. А. Теплов, С. И. Бейлина

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290 Пущино Московской области; факс: (4967)790553; электронная почта: beylina@.iteb.ru Поступила в редакцию 01.07.2009 г.

Для выяснения роли активируемого инозит-1,4,5-трисфосфатом (IP3) ретикулярного Са2+-канала (IP3R) в автоколебаниях сократительной активности плазмодия Physarum polycephalum использован 2-аминоэтоксидифенилборат (2-АРВ), ингибитор 1Р3-зависимого высвобождения Са2+. Принимая во внимание показанное для IP3R типа I уменьшение ингибиторной эффективности 2-АРВ с ростом концентрации IP3 [Bilmen J.G., Michelangeli F. // Cell Signal. 2002. V. 14 (11). P. 955—960], влияние 2-АРВ на автоколебательное поведение плазмодия исследовали как в норме, так и под действием стимулирующих продукцию IP3 аттрактантов: глюкозы и ее рецепторного аналога 3-О-метилглю-козы. Показано, что 2-АРВ в концентрации 20 и 50 мкМ вызывает обратимое прекращение автоколебаний сократительной активности, происходившее в двух разных режимах: быстрой остановки и постепенного затухания. Затухание колебаний сопровождалось увеличением их периода, удлинением фазы сокращения и, часто, ростом среднего уровня генерируемой силы. Число образцов, реагирующих на 2-АРВ быстрой остановкой, при 50 мкМ 2-АРВ было в 2 раза большим, чем при 20 мкМ. В присутствии 10 и 50 мМ аттрактантов и 2-АРВ в концентрации 20 мкМ быстрой остановки не наблюдалось, затуханию автоколебаний предшествовал варьирующий по длительности период сохранения регулярного колебательного режима. Полученные результаты позволяют заключить, что быстрая остановка автоколебаний вызвана прямым взаимодействием 2-АРВ с IP3R плазмодия P. polycephalum, а сам IP3R является необходимым компонентом плазмодиального осциллятора.

Ключевые слова: автоколебания, сократительная активность, IP3R, 2-аминоэтоксидифенилборат (2-АРВ), миксомицеты, плазмодий Physarum polycephalum.

Для многих клеток с амебоидным типом подвижности — от низших эукариот до тканевых клеток высших животных, показан автоколебательный характер локомоции и наличие волновых процессов, коррелирующих с миграцией [1— 3]. Механизм автоколебаний остается невыясненным, несмотря на успехи в исследовании молекулярных основ подвижности и контролирующих ее сигнальных путей. Плазмодий миксоми-цета Physarum polycephalum — гигантская многоядерная клетка с постоянно поддерживающимися и легко регистрируемыми колебаниями активности сократительного аппарата и концентрации внутриклеточных мессенджеров, в первую очередь интересен именно как объект исследования механизма автоколебаний и автоСокращения: 2-АРВ — 2-аминоэтоксидифенилборат; IP3 — инозит-1,4,5-трисфосфат; IP3R — рецептор инозит-1,4,5-трисфосфата; RyR — рианодиновый рецептор; CICR — Са2+-индуцируемое высвобождение кальция; SOC — каналы емкостного входа, SERCA — Са2+-АТР-аза сарко- и эн-доплазматического ретикулума; BHQ — 2,5'-ди-терт-бу-тил-1,4-бензогидрохинон, ингибитор SERCA.

волн. Не менее привлекателен плазмодий и с точки зрения консервативности и эволюционной древности сигнальных систем, поскольку генетический анализ эволюции эукариотических клеток показал, что группа ЛтоеЪо2оа, включающая Physarum и клеточный миксомицет В1с1уо81е1шт discoideum, очень рано отделилась от ветви, в которой возникли животные [4].

Подвижность плазмодия обеспечивают хорошо координированные периодические сокращения, обусловленные взаимодействием миозина с актиновыми филаментами под плазматической мембраной. Сокращения вызывают течение протоплазмы, направление и скорость которого меняются в автоколебательном режиме. Результирующий перенос массы происходит за счет более мощного или более длительного потока в направлении перемещения. Автоколебания сократительной активности сопровождаются синхронными колебаниями внутриклеточной концентрации Са2+, возрастающей до 420 нМ в фазе сокращения и снижающейся до 320 нМ в фазе расслабления [5]. Период автоколебаний меняет-

ся в диапазоне от 1 до 5 мин в зависимости от функционального состояния плазмодия, а также в ответ на внешние стимулы [6]. Внутриклеточные хранилища Са2+ в плазмодии представляют собой мембранные пузырьки, содержащие органический матрикс (возможно, Са2+-связываю-щий белок) и выявляемый c помощью пироанти-моната калия плотный осадок кальция [7]. Рентгеновский микроанализ показал, что в состав частиц, наряду с кальцием, входит фосфат [8]. Показано также, что основным белком мембран этих везикул является Са2+-АТР-аза с молекулярной массой 105 кДа [9], реагирующая с антителами против Са2+-АТР-азы саркоплазматического ретикулума быстрых скелетных мышц кролика, что указывает на ее сходство с SERCA [10]. Общее содержание кальция в плазмодии, выращенном на стандартной культуральной среде, достигает 18 мМ [11].

Плазмодиальный осциллятор относительно независим от внешней концентрации кальция, поскольку автоколебания изометрической силы продолжаются более 1 ч в среде, содержащей EGТА [12]. Они сохраняются, хотя и модифицируются, и в присутствии ингибиторов рианоди-нового рецептора (RyR) [13].

Настоящая работа продолжает наши исследования связи плазмодиального осциллятора с рецептором IP3 (IP3R), на которую указывал характер действия ингибиторов фосфолипазы C — неомицина и U73122 [14]. Использованный нами ингибитор 2-аминоэтоксидифенилборат (2-АРВ) был введен в экспериментальную практику как проникающий антагонист IP3R [15]. Анализ его действия на разные типы возбудимых и невозбудимых клеток показал, что он действительно является селективным ингибитором 1Р3-зависимо-го высвобождения Са2+, однако в качестве потенциальных мишеней 2-АРВ необходимо рассматривать не только IP3R, но и депо-зависимый вход Са2+ и Са2+-АТР-азу ретикулярной мембраны [16]. Концентрации, при которых 2-АРВ ингибирует высвобождение Са2+, варьируют в зависимости от типа клеток, стимула и, по данным [17], концентрации IP3. Поскольку последнее служит важным указанием на прямое взаимодействие 2-АРВ с IP3R, мы исследовали действие этого ингибитора на автоколебательное поведение плазмодия в норме и в присутствии аттрак-тантов, рецепция которых способна стимулировать продукцию IP3.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использованы глюкоза "Serva" (Швейцария), агар "Difco" (США), HEPES, 3-O-метилглюкоза и 2-АРВ "Sigma" (США). В каче-

стве растворителя 2-АРВ использован предварительно перегнанный метиловый спирт квалификации х.ч., ОАО "АКРОН" (Россия). Стоковый раствор 2-АРВ (100 мМ) хранили при —20°С.

Плазмодий P. polycephalum штамм BKM(F) 3283 выращивали в поверхностной культуре с подкормкой овсяными хлопьями по методу [18]. Через 5—6 ч после подкормки плазмодий начинал распространяться по подложке и по мере продвижения переднего края сплошная пленка протоплазмы трансформировалась в сеть протоплазма-тических тяжей. Использованные в опытах отрезки тяжей и вытекающие при проколах плазмодия капли протоплазмы изолировали через 12—15 ч после подкормки плазмодия. В обоих образцах через несколько секунд восстанавливается целостность плазматической мембраны [19], а через 10—15 мин возобновляется течение протоплазмы и сократительная активность.

Капли протоплазмы, использованные в качестве образцов для оценки двигательной активности плазмодия, через 10—15 мин после получения переносили на подложки из 2% агарового геля, содержащие 2-АРВ. Ингибитор и метиловый спирт, вводившийся в контрольные подложки в концентрации, соответствующей его содержанию в растворе 2-АРВ, вносили в расплавленный агар перед застыванием. Результаты наблюдений документировали в виде цифровых изображений с помощью сканера "Astra 6700 UMAX" (Англия).

Автоколебания регистрировали по изменениям продольной силы, генерируемой изолированными тяжами в изометрических условиях [20]. Отрезки тяжей длиной около 4 мм и диаметром 250—400 мкм фиксировали клеем БФ-6 на крючках высокочувствительного тензиометра [20] и погружали в кювету с контрольным раствором, содержавшим 0.1 мМ CaCl2 и 10 мМ HEPES, pH 7.2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В качестве критерия оценки общего действия 2-АРВ на плазмодий использовали сохранение его способности к движению. Как видно из рис. 1, двигательная активность регенерировавших из капель протоплазмы плазмодиев существенно уменьшалась на подложках, содержащих 10 мкМ 2-АРВ, и полностью подавлялась при более высоких концентрациях ингибитора. В течение 6 ч наблюдения при больших, чем 10 мкМ, концентрациях 2-АРВ контур плазмодиев не изменялся, что свидетельствует о прекращении возвратно-поступательного течения протоплазмы и, следовательно, автоколебаний силы. Существенно, что при этом не отмечено признаков некроза или апопто-за. Их отсутствие позволяло предполагать, что

Рис. 1. Подавление двигательной активности плазмодиев, регенерировавших из капель протоплазмы, на подложках, содержащих 2-АРВ. В контрольную подложку был введен метиловый спирт в концентрации, соответствующей 100 мкМ 2-АРВ. Съемка через 6 ч от начала опыта. Масштабный отрезок — 10 мм.

60 80 Время, мин

140

Рис. 2. Два типа вызываемого 20 мкМ 2-АРВ прекращения автоколебаний развиваемой тяжом продольной изометрической силы: быстрое и полное подавление колебаний (а) и постепенный выход из автоколебательного режима (б).

показанное на многих клетках повышение внутриклеточной концентрация Са2+ под действием 2-АРВ [16], если и происходит, то не достигает значений, провоцирующих клеточную гибель.

При инкубации плазмодия в 10—50 мкМ растворах 2-АРВ в течение 40—60 мин и последующей отмывке в течение 10 мин способность к движению на контрольных агаровых подложках сохранялась. Если использовали ингибитор в концентрации 100 мкМ и время инкубации более 20 мин, то действие 2-АРВ было необратимым. С учетом этого в экспериментах на протоплазмати-ческих тяжах использовали 2-АРВ в концентрации 20 и 50 мкМ, и во всех опытах прове

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком