БИОФИЗИКА, 2012, том 57, вып. 5, с. 764-770
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =
УДК 577.3
ПОДАВЛЕНИЕ ГИПЕРП Р ОНИЦАЕМОСТИ СО СУДИСТОГО ЭНДОТЕЛИЯ С ПОМОЩЬЮ ПРОНИКАЮЩИХ ПЕПТИДНЫХ ИНГИБИТОРОВ КИНАЗЫ ЛЕГКИX ЦЕПЕЙ МИОЗИНА
© 2012 г. А.Ю. Хапчаев, М.В. Самсонов, О.А. Казакова, Е.Л. Вилиткевич, М.В. Сидорова, А.А. Азьмуко, А.С. Молокоедов, Ж.Д. Беспалова, В.П. Ширинский
ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития РФ,
121552, Москва, 3-я Черепковская ул., 15а E-mail: $Ыптку@сагйю.ги Поступила в p едакцию 11.07.12 г.
На основе пептидного ингибитора киназы легких цепей миозина L-ПИК (Arg-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-Arg-Lys) разработаны новые модифицированные пептидные ингибиторы. Исследовано их влияние на индуцированное тромбином повышение проницаемости сосудистого эндотелия в культуре. Установлено, что соединения ПИК2 ([NaMeArg1]-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-(D)Arg8-Lys) и ПИК4 (H-Arg(NO2)Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-Arg-Lys-NH2) обладают наиболее высокой способностью подавлять гиперпроницаемость сосудистого эндотелия, превосходя все известные аналоги, созданные на основе пептидного ингибитора L-ПИК. На основании полученных результатов ПИК2 и ПИК4 могут рассматриваться как лидирующие молекулы при разработке новых пептидных лекарственных средств для борьбы с патологическим повышением проницаемости сосудистого эндотелия.
Ключевые слова: пептид, ингибитор, киназа легких цепей миозина, гиперпроницаемость, сосудистый эндотелий.
Сосудистый эндотелий играет роль бар ьера между кровью и тканью, а также выполняет ряд важных функций: регулирует тонус глад-комышечных клеток сосудов и гемодинамику, иммунные реакции, ангиогенез, гемостаз и др. В капиллярах эндотелий обеспечивает обмен веществ между кровью и тканями. Важным физиологическим свойством эндотелиального монослоя выступает его избирательная проницаемость. Нарушение барьерной функции эндотелия сопровождается повышением проницаемости сосудистой стенки и развитием отека ткани, последствия которого могут варьировать от незначительных до катастрофических в том случае, если поражаются легкие, мозг и другие жизненно важные органы. Такая пр облема нередко наблюдается при ряде патологических состояний, таких как воздействие токсических веществ, острая сердечная недостаточность, патология клапанов сердца, почечная недостаточность, цирроз печени, онкологические заболевания и др., и, несмотр я на достижения совр е-менной медицины, продолжает оставаться при-
Сокращения: КЛЦМ - киназа легких цепей миозина; ЛПС - липополисахарид; ПИК - пептидный ингибитор киназы; РЛЦ - регуляторные легкие цепи; ФИТЦ - флуо-ресцеинизотиоцианат.
чиной высокой смертности, даже в условиях стационарного лечения. Для борьбы с отеком используются диуретики, кристаллоиды и стероидные гормоны. Эти соединения улучшают выведение жидкости из организма, но не воздействуют на молекулярные механизмы развития отека - повышение пр оницаемости эндоте-лиальной выстилки микрососудов, возникающей вследствие сократительной активности эн-дотелиальных клеток.
Одним из ключевых регуляторов сократительной активности клеток, в том числе и эндотелиальных, является киназа легких цепей миозина (КЛЦМ). Этот фермент активируется при действии многих эдемагенных факторов, таких как тромбин, брадикинин, гистамин, про -воспалительные интерлейкины, фактор некроза опухоли, фактор роста эндотелия сосудов, активные формы кислорода, избыточные физико-химические воздействия. Роль КЛЦМ в развитии острого отека легких убедительно про -демонстрирована с использованием генетического нокаута эндотелиальной изоформы КЛЦМ [1], а также обоснована возможность использования КЛЦМ в качестве молекулярной мишени для предотвращения острого отека легких [2].
Модификации пептидного ингибитора киназы легких цепей миозина Ь-ПИК, использованные в р аботе
Пептид Модификация
L-ПИК [б] Не модифицирован
ПИК2 (N^метил-Arg в положении 1, D-Arg в положении 8
ПИКЗ (N ^метил-Arg в положении 1, пептидная цепь удлинена c C-конца на трипептид Pro-Gly-Pro
ПИК4 Нитрогуанидиновая группа у остатка Arg в положении 1
ПИК5 Псевдопептидная связь между остатками Arg1 и Lys2, D-Arg в положении 8
ПИКб Псевдопептидная связь между остатками Arg1 и Lys2, пептидная цепь удлинена с C-конца
на трипептид Pro-Gly-Pro
Цикло-ПИК Циклический аналог L-ПИК, где свободные Na-аминогpуппа остатка Arg1 и карбоксильная группа остатка Lys9 соединены между собой пептидной связью
Однако большинство существующих ингибиторов КЛЦМ не подходит для применения у человека по причине серьезных побочных эффектов. В этой связи актуален поиск ингибиторов КЛЦМ, характеризующихся фармакологически привилегированной структурой и высокой специфичностью. Одним из таких соединений является низкомолекулярный ингибитор, созданный на основе аминопиридазина [1,3,4]. В последние годы в мире на основе автоинги-биторного участка КЛЦМ [5] разрабатываются пептидные ингибиторы КЛЦМ. Так, нонапеп-тид H - Arg-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-Arg-Lys-NH2 (L-ПИК) [6] способен проникать через плазматическую мембрану и влияет на эпителиальную проницаемость in vitro [7], однако в силу особенностей его химической структуры чрезвычайно подвержен действию протеолити-ческих ферментов [8], что ставит под сомнение возможность его применения в практической медицине. Модификация пептида L-ПИК путем замены входящих в его состав L-аминокислот на D-конфигур ацию, как и следовало ожидать, привела к повышению устойчивости пептида к протеолитической деградации [7,9], однако ин-гибиторная активность D-ПИК уступала таковой L-ПИК, по-видимому, вследствие того, что D-ПИК является полным энантиомером L-ПИК и обладает иной пространственной структурой [9]. Тем не менее D-ПИК при внутривенном введении эффективно снижал степень отека легких у крыс, вызванного введением в кровь олеиновой кислоты [10].
Поскольку в ряду пептидных аналогов не существует четкой взаимосвязи между структурой и биологической активностью, внесение модификаций в структуру пептида может кардинально сказаться на его ингибиторных свойствах. Так, при сравнении пептидных ингибиторов КЛЦМ с различными вариантами модификации стр уктуры исходного L-ПИК (D-ПИК,
[N aMe-Arg1]-ПИК, [eAca1]-ПИК, [Сй^-ПИК, [Сй^От-^-ПИК) ранее нами было показано, что активностью in vitro, сопоставимой c исходным L-ПИК, обладает только [NaMe-Arg1]-ПИК (ПИК1) с модификацией N-концевой аминокислоты исходного пептида L-ПИК [9]. Время жизни ПИК1 в плазме крови in vitro почти в три раза превышало время жизни L-ПИК, и в концентрации 100 мкМ ПИК1 снижал индуцированное тромбином повышение проницаемости монослоя эндотелиальных клеток [11].
В настоящей работе проведено сравнение ингибитор ных свойств новых и известных модификаций ПИК в моделях стресс-индуциро-ванной гиперпроницаемости эндотелия в культур е. На основании полученных результатов выбраны пептидные молекулы, представляющие наибольший интерес для дальнейшей разработки лекарственных средств для предотвращения развития гиперпроницаемости сосудистого эндотелия.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Использовали набор пептидных ингибиторов КЛЦМ на основе L-ПИК, синтезированных в ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоц-развития РФ (таблица). Все реактивы общего назначения были аналитической чистоты и приобретены в фирмах «ДиаМ» (Россия), Sigma (США), Serva (Гер мания), Fluka (Швейцария), Bio-Rad (США). И спользовали также тромбин (Enzyme Research Laboratories, США), флуор ес-цеинизотиоцианат (ФИТЦ)-альбумин, ЛПС из бактерий Escherichia coli и желатин (Sigma, США).
Культивирование эндотелиальных клеток.
Использовали культуры эндотелиальных клеток EA.hy926 (АТСС, США) и ЫМУЕС-L (Human MkrovasOTlar Endothelial Cells - Lung) (Lonza,
CША). Клетки культивировали в атмосфере 5% CO2 при 37°C в присутствии антибиотиков и 10% эмбриональной бычьей сыворотки (HyC-lone ^ША)). Для клеток EA.hy926 использовали базовую среду роста ДМЕМ (ПанЭко, Россия), культивирование клеток HMVEC-L проводили в ср еде EGM 2 MV (Lonza, CША). Питательную среду меняли на свежую каждые 2 дня.
Определение проницаемости ФИТЦ-альбу-мина через монослой эндотелиальных клеток in vitro. Для экспериментов использовали 24-лу-ночные планшеты фир мы Greiner Bio-one (Германия) со специальными вкладышами, образующими внутренние камеры, дно которых представляет собой пористую мембрану с диаметром пор 0,4 мкм. Клетки EA.hy926 высаживали на мембраны, предва рительно покрытые раствором 0,2% желатина, в количестве 2-104 клеток на мембр ану и культивировали в инкубаторе при 37°C и 5% C02 до формиро-вания монослоя. В день эксперимента клетки в течение 1 ч депривировали в среде роста с 0,1% сывороткой, инкубировали с исследуемыми пептидами, добавленными в обе камеры в конечной концентрации 20-100 мкМ в течение 1 ч и затем в верхние камеры вносили ФИТЦ-альбумин в конечной концентрации 1 мг/мл. Через 1 ч из нижней камер ы отбирали 10 мкл для определения базовой проницаемости монослоя эндотелиальных клеток и стимулировали развитие гиперпроницаемости эндотелиального монослоя внесением тромбина до конечной концентрации 100 нМ. Затем каждые 30 мин в течение 4 ч из нижней камеры отбирали пробы и определяли интенсивность флуоресценции ФИТЦ с помощью планшетного сканера Vktor 3X (Perkin Elmer, ОТА) при Абх = 495 нм и Aem = 535 нм. Эксперименты проводили в трипликатах, данные представляли как среднее ± стандартное отклонение.
Измерение электрического сопротивления эн-дотелиального монослоя in vitro. Для экспериментов клетки HMVEC-L культивировали на чашках диаметром 100 мм, покрытых 0,2% желатином, до достижения раннего монослоя. Клетки снимали с чашки 0,15% трипсином на растворе Версена и высеивали на 8-луночный планшет ECIS Cultureware 8w1e ^рр^ё BioP-hys^s 1пс., CША), покрытый 0,2% желатином в количестве 0,5-105 клеток на лунку. Два планшета с клетками устанавливали в держатель, соединенный с прибором ESISz ^рр^ё BioP-hys^s 1пс., CША), через 1-1,5 ч регистрации данных вносили пептидные ингибиторы КЛЦМ в конечной концентр ации 100 мкМ. Затем через
45 мин вносили ЛПС из бак
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.