МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =
УДК 577.963.3
ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ЭФФЕКТА УМЕНЬШЕНИЯ ЖЕСТКОСТИ ПОЛИМЕРНОЙ ЦЕПИ ДНК ФАГА X В ВОДНОМ РАСТВОРЕ В УСЛОВИЯХ МАЛЫХ ИОННЫХ СИЛ ПОСРЕДСТВОМ АНАЛИЗА ХАРАКТЕРА ПОЛИМЕР-ПОЛИМЕРНЫХ МЕЖЗВЕНЬЕВЫХ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ
© 2011 г. А.В. Арутюнян, М .А. Иванова, Д.И. Курлянд*, Ю.С. Капшин,
С.Б. Ланда, С.Т. Пешехонов, Е.А. Дробченко, И.В. Шевелев,
Петербургский институт ядерной физики РАН, 188300, Ленинградская область, Гатчина, Орлова Роща; *Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, 01601, Киев, ул.Леонтовича, 9, Украина
Поступила в р едакцию 29.07.10 г.
Методом лазерной корреляционной спектроскопии изучены изменения жесткости полимерной цепи двунитевой ДНК фага X. Показано, что с увеличением ионной силы в водном растворе ДНК возникает специфический для полимерных клубков эффект экранировки гидродинамического взаимодействия звеньев полимерной цепи. Предполагается, что данная экранировка может наблюдаться при достижении порога перекрывания клубков ДНК. Перекрывание достигается в результате увеличения размера клубка от аномально малых значений в буфере с низкой ионной силой при (концентрации меньше либо порядка 10-2 М) до максимальных значений в ББС-буфере с высокой ионной силой и в аналогичных буферах. Анализ дальних межзвеньевых взаимодействий в клубке ДНК фага X в близких по ионной силе буферах при рН 7 и рН 4 подтверждает предложенную ранее гипотезу о предпочтительной электростатической экранировке ДНК ионом Н+ при низких ионных силах, вследствие чего, по-видимому, и происходит аномальное уменьшение размера клубка ДНК в этих условиях, не являющееся специфическим только для ДНК фага X.
Ключевые слова: ДНК фага X, ДНК фага Т7, лазерная корреляционная спектроскопия, кумулянт, размер клубка, экранировка гидродинамического взаимодействия звеньев.
Основная цель данной работы - показать с помощью лазерной корреляционной спектроскопии (ЛКС), что с р остом ионной силы в водном растворе двухнитевой ДНК фага X возникает специфический для полимерных клубков эффект экранировки гидродинамического взаимодействия звеньев полимерной цепи [1].
Экранировка гидродинамического взаимодействия звеньев должна наблюдаться при достижении порога перекрывания клубков ДНК [1,2]. Это, по всей видимости, и происходит с увеличением размера клубка от аномально малого значения (в растворах с концентрацией солей меньше либо порядка 10-2 М) до максимального значения (в 58БС-буфере и в аналогичных ему по ионной силе растворах) вследствие увеличения жесткости (персистентной длины) ДНК [3,4]. Таким образом, демонстра-ция в данной работе специфического эффекта -
Сокращение: ЛКС - лазерная корреляционная спектроскопия.
возникновения экранировки гидродинамического взаимодействия звеньев полимерной цепи в клубке ДНК фага X - служит подтверждением обнаруженного ранее [3,4] эффекта сильного изменения жесткости (персистентной длины) в исследуемой ДНК.
Проведенный с помощью ЛКС анализ объемны х взаимодействий в клубке ДНК фага X в близких по ионной силе буферах при рН 7,0 и рН 4,0 также подтверждает, что обнаруженная в работах [3,4] сильная потеря жесткости полимерной цепи ДНК в растворах со сравнительно малой ионной силой (концентрация Ка+ меньше либо порядка 10-2 М) не артефакт, - результат проявления «блобных» структур вследствие перекрывания клубков с объемным взаимодействием звеньев [1,5]. Другими словами, анализ объемных взаимодействий в этих образцах указывает на то, что в растворах со ср авнительно малыми ионными силами наблюдается не «кусок» клубка - блоб, а целиком клубок сильно уменьшившегося р азмера.
Эффект сильной потери жесткости цепи ДНК при низких ионных силах не является специфическим для Х-ДНК, а, по всей видимости, характерен для любой линейной двухни-тевой ДНК достаточно больших р азмеров. Это демонстр ир уется пр ямым измерением размеров клубка в соответствующих условиях для ДНК фага Т7 и ДНК линеаризованной плазмиды аналогично тому, как это делалось для ДНК фага Х в работах [3,4].
Потеря жесткости ДНК при низких ионных силах не является прямым проявлением ее свойств как полиэлектролита, а свидетельствует о сложной специфике этой двухцепочечной молекулы, стабилизир ованной водор одными связями и стэкингом оснований, свойства которой определяются наличием заряженных групп далеко не в первую очередь. C этой точки зрения наблюдаемый эффект противоречит поведению «классических» полиэлектролитов, поскольку не связан с изменением электростатической пер-систентной длины в результате экранировки контрионами (см. раздел «Обсуждение результатов и выводы»).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Все анализируемые экспериментальные результаты с использованием ДНК фага Х получены методом лазер ной корреляционной спектроскопии [3,4,6] на установке в Институте биохимии им. Палладина АН Украины (Киев). Источниками излучения служили два одномо-довых лазера: гелий-неоновый - 8рес1га-РЬу81с8 127 - с длиной волны 632,8 нм и мощностью 50 мВт и аргоновый лазер - Ьехе1 85-1 - с длиной волны 488 нм и мощностью 1 Вт. Реальная мощность излучения лазеров в эксперименте составляла 50 и 300 мВт соответственно. Гомодинную автокорреляционную функцию рассеянного света измеряли коррелятором К7032s фирмы MALVERN. Диапазон углов ра с-сеяния в эксперименте (10-150°) обеспечивал гониометр SP-86 фирмы ALV-Laser. Парную корреляционную функцию рассеянного света G(1)(t) вычисляли из измеряемой гомодинной автокорреляционной функции с помощью со -отношения Зигерта [6]. Необходимые физические параметры из парной корреляционной функции были получены решением обратной спектральной задачи с помощью процедуры регуляризации [4].
Измерения размеров клубка для ДНК фага Т7 и плазмиды pFLA590m методом ЛКС про -ведены на экспериментальной установке в Петербургском институте ядер ной физики [3,4], с усовершенствованными регистрирующим и ана-
лизирующим модулями. Фотоприемником служил кремниевый пин-фотодиод 87911 (Ната-та18и, Япония). Сигнал с фотодиода анализировали, как описано в работе [4], спектроана-лизатором служила многофункциональная АЦП/ЦАП плата Ь780 с сигнальным процессором ЛБ8Р2185М на РС1-шине, разр аботанная ЗАО «Ь-СЛИБ». Точный учет спектра шума лазера и регистрирующего тракта позволил осуществить достаточно качественную подгонку спектров с помощью процедуры регуляризации [4].
ДНК фага Т7 (39937 п.н.) и плазмиды рБЬЛ590т получены в Петербургском институте ядерной физики. Плазмида рБЬЛ590т представляет собой двухнитевую циклическую ДНК длиной 7057 п.н. Линеаризация плазмиды осуществлена эндонуклеазой ЕсоШ по уникальному сайту. Контроль реакции осуществляли с помощью электрофореза.
И спользуемые материалы, контроль и подготовка образцов ДНК к оптическим измерениям, в том числе и методика практически полной очистки образца от пыли, подробно изложены в работе [4].
НЕОБХОДИМЫЕ С ВЕДЕНИЯ ИЗ ТЕОРИИ ЛАЗЕРНОЙ КОРРЕЛЯЦИОННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ ДЛЯ РАСТВОРОВ ПОЛИМЕРОВ
Парная корреляционная функция рассеянного света (фурье-прообраз спектра) для клубка полимер а в р астворе для достаточно больших углов рассеяния пр едставляет собой сумму трансляционной и внутренних релаксационных мод - экспонент с «вкладом» Ау [4,6]:
С(1)Ш) = ЕА-ехр (-Г/)). (1)
Здесь Г - так называемые обратные времена релаксации этих мод, q - модуль волнового вектора рассеяния,
q = (4пп/Х0)8Ш(Ф/2) = 2л/Ь, (2)
q определяет масштаб Ь тех флуктуаций плотности в полимерном растворе, на которых про -исходит рассеяние света с длиной волны ^0 под заданным углом Ф, п - коэффициент преломления растворителя.
Набор всех Гу и Ау определяет характерный параметр клубка, так называемый кумулянт Г -коэффициент начального наклона корреляционной функции:
Г = Ътй&Щ,г)/си = (1Л}Г})/1ЛГ (3)
Поведение Г как функции д определяется а) наличием или отсутствием так называемых объемных взаимодействий звеньев внутри клубка молекулы полимера, б) наличием или отсутствием гидродинамического взаимодействия звеньев полимера вследствие увлечения окружающей жидкости при движении звена, что влияет на движение других звеньев. В пределе дЯ >> 1 (Я - характерный размер клубка) существуют точные выражения для Г(д) с учетом или без учета указанных факторов. Для исторически первой модели - модели Рауза -динамики клубка молекулы полимера в растворе, без учета гидродинамического и объемного взаимодействий [1,2,7]:
Г(д) = д4а2кГ /(12£),
(4)
где - коэффициент трения статистического сегмента молекулы («звена») длиной а; к -постоянная Больцмана; Т - температур а. Однако экспериментальные результаты свидетельствуют о справедливости модели Зимма, учитывающей гидродинамическое взаимодействие звеньев в клубке. В р амках этой модели
Г(д) = 0,0625д3кТ/г|
(5а)
для идеального или гауссова клубка, т.е. для ©-условий, когда нивелированы или пренебрежимо малы объемные взаимодействия звеньев; и
Г(д) = 0,0788д3кТ/г|
(5б)
для клубка с объемным взаимодействием звеньев (или, по-другому, с исключенным объемом). Здесь п - вязкость растворителя [2,6,7].
Теоретически предсказанные асимптотики (4) и (5) могут служить инструментом для экспериментального анализа характера взаимодействия звеньев через среду в полимерном клубке.
Еще раз подчеркнем, что в предлагаемой работе кумулянт Г(д) вычислялся с помощью процедуры регуляризации [4], т.е. по второй половине формулы (3), по измеренному набору
Г и а.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗМЕРЕНИЙ
Все приведенные на рисунках результаты измерений Г(д) показаны в универсальных, мас-штабир ованных («скейлинговых») координатах. Г нор мирована на Г(д ^ 0)6п, где Г(д ^ 0) = Го = .Од2 - обратное время релаксации транс-
ляционной моды, О = кТ/(6ппД - коэффициент диффузии клубка (формула Эйнштейна-Стокса), д - абсцисса - масштабирована характерным размером клубка Яего гидродинамическим радиусом.
Во всех анализируемых образцах концентрация ДНК фага X постоянна и равна 160 мкг/мл.
На рис. 1а,б приведены результаты измер е-ний Г(д) из работы [3] для образцов в 58БС-буфер е и в его аналоге по ионной силе вместе с р езультатами измерений Г(д) таких же образцов в тех же условиях для больших углов рассеяния. На рис. 1в показана зависимо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.