ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2008, том 55, № 4, с. 529-534
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 581.13.133:582.29.263
ПОГЛОЩЕНИЕ НИТРАТА БИОНТАМИ, ВЫДЕЛЕННЫМИ ИЗ ЛИШАЙНИКА Parmelia sulcata
© 2008 г. Е. А. Павлова, А. И. Маслов
Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук, Пущино, Московская обл.
Поступила в редакцию 21.06.2007 г.
На изолированных микобионте и фотобионте из таллома лишайника Parmelia sulcata Taylor, показано существенное различие между ними в отношении ассимиляции нитрата. Препарат очищенного фото-бионта, зеленая водоросль Trebouxia sp., оказался неспособным к поглощению нитрата. Препараты ми-кобионта и фрагменты таллома, содержащие оба бионта, поглощали нитрат. Свет не оказывал существенного влияния на скорость поглощения. Ингибитор дыхания, азид натрия, снижал скорость на 80-100%, тогда как ингибитор фотосинтетического транспорта электронов, дихлорфенилдиметилмо-чевина, не влиял на поглощение нитрата. С помощью масс-спектрометрии показано, что в интактном талломе лишайника нитрат поглощался микобионтом и лишь затем начинал поступать в фотобионт. Дискриминация по азотному питанию между бионтами лишайника, возможно, служит одним из механизмов контроля гриба-хозяина над ассоциированными зелеными водорослями и поддерживает их симбиоз.
Ключевые слова: Parmelia sulcata - Trebouxia sp. - лишайник - таллом - фотобионт - микобионт -нитрат - поглощение.
ВВЕДЕНИЕ
Лишайники представляют собой симбиотиче-скую ассоциацию гетеротрофного гриба (мико-бионта) и автотрофной водоросли (фотобионта). Фотосинтезирующими компонентами лишайников обычно являются зеленые одноклеточные водоросли, реже - цианобактерии или и те, и другие вместе.
Основу симбиоза составляет интеграция метаболических систем бионтов, объединяющая обмен основными элементами питания, такими как углерод и азот, которая отражает взаимосвязь генетических систем бионтов [1]. Обмен углерода, посредством которого осуществляется снабжение микобионта продуктами фотосинтеза водорослей, интенсивно изучается [2, 3]. Считается, что до 90% ассимилированного неорганического углерода утилизируется в клетках микобионта.
Интеграция азотного метаболизма между бионтами менее изучена и касается, прежде всего, лишайников, содержащих в качестве фотобионта цианобактерии [4, 5]. Стратегию азотного обмена этой группы лишайников определяет способность цианобактерий фиксировать атмосферный азот, который затем перераспределяется между
Сокращения: Хл - хлорофилл; БСМи - дихлорфенилдиме-тилмочевина.
Адрес для корреспонденции: Павлова Елена Алексеевна. Московская обл., 142290 Пущино, Институтская ул., 2. Институт фундаментальных проблем биологии РАН. Факс: 007 (496) 733-05-32; электронная почта: helen@ibbp.psn.ru
бионтами. Лишайниковые ассоциации, содержащие зеленые водоросли, зависят от источников неорганического и органического азота субстрата и воды. Они лимитированы по азотному питанию [5, 6] и, как правило, содержат значительно меньше азота в сухом веществе [4] и заметнее реагируют на экзогенно добавленный азот, чем лишайники с ци-анобактериальным фотобионтом [7, 8].
В последнее время возрастает интерес к проблеме азотного питания лишайников, содержащих зеленые водоросли. Изучались скорости поглощения различных форм азота, накопление и перераспределение азотистых веществ в талломах разных видов лишайников [9, 10], различающихся морфологически и экологически [11, 12]. Все эти работы были проведены на целых талломах лишайников, т.е. исследователи имели дело с интегрированными показателями обмена. В связи с этим, актуальным становится изучение элементов азотного обмена, связанного с индивидуальными бионтами.
В настоящей работе были оценены скорости поглощения иона нитрата изолированными бионтами лишайника Parmelia sulcata, содержащего зеленую водоросль Trebouxia sp. Изучали роль света в процессе ассимиляции нитрата, так как известно, что у свободноживущих одноклеточных зеленых водорослей восстановление нитрата функционально связано с фотосинтезом, который поставляет энергию и углеродные скелеты для нитратредукции [13, 14]. С помощью изотопа
15N изучали передвижение ассимилированного азота между бионтами лишайника. Основной задачей было показать существование интеграции азотного метаболизма у лишайника, содержащего в качестве фотобионта зеленую водоросль.
МЕТОДИКА
В работе использовали свежие талломы лишайника Parmelia sulcata Taylor, собранные в весенний период в Пущино, Московской обл. После отмывания 10 г сырого материала разрушали в блендере при 14 000 об./мин в 100 мл 10 мМ фосфатного буфера, рН 7.2, двумя циклами по 10 с. Крупные фрагменты таллома отделяли фильтрованием через нейлоновое сито, а более мелкие фракционировали, как было описано ранее [15]. В результате получали две фракции фрагментов таллома: обогащенные фотобионтом и мико-бионтом.
Препараты очищенного фотобионта получали из фракции фрагментов таллома, обогащенных фотобионтом путем растирания в стеклянном гомогенизаторе тефлоновым пестиком, многократной фильтрации через ткань для быстрого фильтрования Miracloth ("Calbiochem", США) и центрифугирования в градиенте плотности Per-coll ("Pharmacia", Швеция) [15].
Способность к поглощению нитрата оценивали по изменению его концентрации в среде инкубации образцов - 10 мМ фосфатном буфере, рН 6.0, при начальной концентрации KNO3 - 200 мкМ. Для этого препараты многократно промывали в дистиллированной воде и буфере до полного исчезновения следов нитрата и темной окраски, возникающей при разрушении таллома. Образцы инкубировали в темноте или на свету с потоком квантов 800 мкмоль/(м2 с), при температуре 20-22°С и продувке воздухом.
Содержание нитрата определяли спектрофо-тометрическим методом [16]. Для этого в процессе экспонирования через определенные промежутки времени отбирали по 0.7 мл суспензии как из тестируемого образца, содержавшего внесенный нитрат, так и из аналогичной пробы, не содержавшей добавленного нитрата. Центрифугированием при 5000 g отделяли клетки от среды, и к 0.5 мл надосадочной жидкости добавляли 0.45 мл 10%-ной HClO4 и 0.05 мл 10%-ной сульфа-миновой кислоты. Оптическую плотность регистрировали при 210 нм, заполняя кювету сравнения надосадочной жидкостью соответствующего варианта, не содержавшей нитрат.
Меченый по азоту нитрат давали в виде натриевой соли с содержанием 15N 95%. Талломы (10 г сырой массы) разрезали на полоски 1 мм шириной, отмывали водой и инкубировали в 250 мл 2 мМ раствора Na15NO3 в воде при интенсивном
продувании воздухом, на слабом свету. После 1 ч инкубации талломы отмывали водой, затем 10 мМ раствором немеченого КаК03 и окончательно 1 мМ раствором СаС12 для вытеснения пассивно связанной с клеточной стенкой метки [10]. Вся процедура отмывания длилась около 15 мин. Талломы обсушивали фильтровальной бумагой и инкубировали в стакане, покрытом стеклом в темноте при 100%-ной влажности и комнатной температуре. Пробы таллома (1 г сырой массы) брали через 0, 1, 3, 6 и 20 ч инкубации после отмывания метки. Часть пробы фиксировали нагреванием до 110°С, а из остального материала выделяли клетки фотобионта, очищая его центрифугированием в градиенте плотности Регсо11. Суспензию клеток помещали в ванночки из фольги и фиксировали нагреванием при 110°С. Оба препарата высушивали до постоянного веса при той же температуре и растирали в порошок, который анализировали на изотопный состав азота.
Анализ изотопного состава азота в образцах интактного таллома и очищенного фотобионта проводили на масс-спектрометре МИ-1201 (Россия) после сжигания проб в присутствии окиси меди и поглотителя СО2 - окиси кальция, при температуре 560°С. Измерения проводили относительно атмосферного азота по формуле:
5 N =
Г[ 15N]обр./[ 14n ] обр. V Ю0%, ^ [ N]ст./[ N)
где 5 представляет собой процент превышения содержания 15К в образце (Кобр.) относительно его содержания в атмосфере (Кст.).
Данные табл. 3 получены при работе с выделенными и очищенными в градиенте плотности Регсо11 водорослями и нарезанными полосками талломами лишайника. Препараты таллома и фотобионта инкубировали 1 ч в 2 мМ растворе
Na15NO3
темноте или на свету интенсивностью
800 мкмоль/(м2 с), затем отмывали, как описано выше, высушивали и анализировали содержание изотопа на масс-спектрометре.
Скорость фотосинтеза и дыхания определяли в стеклянной термостатируемой ячейке с электродом Кларка при освещении препарата светом интенсивностью 800 мкмоль/(м2 с) или препарата, находящегося в темноте, в 10 мМ фосфатном буфере, рН 7.2 в присутствии 2 мМ КаЫС03, при 25°С.
Хлорофилл определяли после экстракции горячим метанолом с использованием известных коэффициентов экстинкции [17]. Сухую массу определяли высушиванием проб в ванночках из алюминиевой фольги при 110°С до постоянного веса.
Таблица 1. Характеристика препаратов из таллома лишайника Parmelia sulcata, использованных для определения скорости поглощения иона нитрата
Препарат Скорость видимого фотосинтеза, мкмоль О2/(ч мг Хл) Скорость дыхания, мкмоль О2/(ч мг Хл) Отношение мкг Хл/мг сухой массы
Фотобионт 50.2 ± 5.3 6.8 ± 2.4 23.0 ± 1.8
Микобионт 0 63.7 ± 5.3* 0.8 ± 0.2
Фрагменты таллома 37.5 ± 1.0 13.0 ± 2.7 4.7 ± 0.3
Интактный таллом 13.8 ± 2.3 32.0 ± 2.8 3.0 ± 0.7
Примечание. Представлены средние значения 4-6 биологических повторностей, т.е. проб, взятых в разные дни, и их стандартные ошибки.
* Расчет в мкмоль О2/(ч г сухого веса).
РЕЗУЛЬТАТЫ
В табл. 1 приведены характеристики препаратов, использованных для определения скорости поглощения нитрата. По величине отношения содержания хлорофилла к сухой массе можно оценить соотношение бионтов в препаратах. Из таблицы видно, что в препаратах фотобионта отношение содержания хлорофилла к сухой массе почти на порядок превышало таковое в интакт-ном талломе и, как показали ранее проведенные микроскопические наблюдения [15], почти не содержали грибных гиф, т.е. являлись суспензией очищенных клеток ТтеЪоих1а. Фракция фрагментов таллома, обогащенных фотобионтом, представляла собой фрагменты, в которых содержание фотобионта было выше примерно в два раза
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.