ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 5, с. 698-701
УДК 581.19:577.11
ПОИСК БЕЛКОВЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ЦМС-ИГ ПОДСОЛНЕЧНИКА
© 2004 г. М. В. Дука, Ю. В. Поликарпова
Кафедра биологии растений биолого-почвенного факультета Молдавского государственного университета,
Кишинев Поступила в редакцию 15.12.2002 г.
В работе исследовали пыльцу и пыльники гибрида с восстановленной фертильностью и двух его родительских линий - материнской андростерильной, несущей митохондриальный ген ог/Н522, и отцовской андрофертильной, несущей доминантные аллели ядерного гена ЯГ. С целью выявления белковых маркеров для генетической системы ЦМС-ЯГ подсолнечника были проанализированы цитоплазматические белки методом диск-электрофореза в денатурирующих условиях. В результате проведенных исследований обнаружена фракция с молекулярной массой 43 кД, специфичная для электрофоретических спектров цитоплазматических белков пыльников отцовской линии, и фракция с молекулярной массой 16 кД, характерная для цитоплазматических белков пыльников материнской линии. Не выявлено отличий между электрофоретическими спектрами водорастворимых белков пыльцевых зерен отцовской линии и гибридной формы.
НеНамНш аишш - белковые маркеры - система ЦМС-Я/- пыльники - пыльца
Генетические маркеры имеют большое значение для селекции культурных видов растений и животных. Новые возможности генетического маркирования открылись с использованием белкового отражения генотипа. Белковые маркеры дают возможность выявлять генетическую изменчивость в автогамных популяциях и анализировать аллогамные популяции. На сегодняшний день можно выделить два основных подхода к генетическому маркированию с использованием белковых продуктов генов: один основан на антигенной специфичности белков, другой - на специфичности электрофоретических спектров определенных групп белков, например, полиморфных ферментов, запасных белков семян и др. [1].
Система цитоплазматическая мужская стерильность - восстановление фертильности (ЦМС-ЯГ хорошо изучена в связи с эффектом гетерозиса и ее использованием в создании гибридов [2, 3]. Однако она представляет интерес и для выявления молекулярных механизмов взаимодействия ядерного и митохондриального гене-
Сокращения: ЦМС - цитоплазматическая мужская стерильность, orf - открытая рамка считывания (от open reading frame); Rf - восстановление фертильности (от restoration of fertility).
Адрес для корреспонденции: Дука Мария Васильевна. MD 2009, Молдова, Кишинев, ул. А. Матеевич, 60. Факс: +(3732) 57-76-06; электронная почта: mduca2000-yahoo.com
тического аппарата, проявляющихся на уровне цитоплазмы.
Подобный интерес обуславливается тем, что за нарушение нормального развития мужского гаметофита и фенотипические проявления ЦМС отвечают перестройки в митохондриальном геноме растений, которые ведут к возникновению новых абберантных генов (открытых рамок считывания, фузионного происхождения - open reading frame, orf) [4-6]. Например, для ЦМС подсолнечника характерна химерная рамка считывания orfH522, состоящая из 522 нуклеотидов и соседствующая с atpA-геном в 17-kb реорганизованном регионе митохондриального генома [4, 7], продуктом которой является белок с мол. м. 16 кД [8, 9].
В то же время при введении ядра, несущего Rf-ген(ы), в цМС-цитоплазму возникает генетическая система взаимодействий, результатом которых является восстановление андрофертильнос-ти полученного гибрида [10]. В такой системе может меняться характер экспрессии ядерных и митохондриальных генов, что влечет за собой изменение белкового выражения генома [11-13]. Так, Moneger с соавт. [13] показали, что гены подсолнечника, восстанавливающие фертильность, действуют специфично в генеративных тканях, результатом чего является посттранскрипционное снижение стабильности 3-kb ко-транскрипта atpA-orfH522 и соответственное снижение содержания белкового продукта ог/Н522-гена в пыльниках гибридного поколения. Тканеспецифич-ный характер экспрессии был установлен также и
для митохондриальных ЦМС-генов у нескольких видов растений [12, 14]. Однако связанный с ЦМС 16-кД полипептид обнаруживается также в гипо-котилях [9], листьях и молодых соцветиях подсолнечника [15, 16].
Целью данной работы было выявление белковых маркеров для генетической системы ЦМС-Rf (ЦМС ssp. petiolaris) подсолнечника в электро-форетических спектрах цитоплазматических белков пыльников и пыльцы.
МЕТОДИКА
Растительный материал. Работа проведена со следующими генотипами подсолнечника: 1) анд-рофертильной отцовской линией, гомозиготной по доминантным аллелям ядерного гена Rf и имеющей нормальный митохондриальный геном; 2) андростерильной материнской линией, гомозиготной по рецессивным аллелям гена Rf и несущей митохондриальный ген orfH522, и 3) гибридом Fb гетерозиготным по гену Rf и несущим в митохондриальном геноме ген orfH522.
Материал был собран на экспериментальной базе научно-коммерческого центра "Магросе-лект" (Сорока, Молдова). Цветки собирали в фазе цветения с 2-3 изолированных от перекрестного опыления корзинок каждой линии.
Экстракция белка. Пыльцу и пыльники гомогенизировали с кварцевым песком в охлажденном до 4°С экстрагирующем буферном растворе и центрифугировали 30 мин при 10000 g. Экстрагирующий буферный раствор для пыльников содержал 1 М Трис-HCl, pH 8.0, 7%-ную сахарозу, 1 мг/мл ЭДТА, 2%-ный 0-меркаптоэтанол и 10 г/л поливинилпирролидона (55 кД). Состав экстрагирующего буферного раствора для пыльцы был тем же, что и для пыльников, но с более высокой концентрацией сахарозы (10%) и с исключением поливинилпироллидона. Концентрацию суммарного белка определяли по Bradford [17].
Электрофоретический анализ. При подготовке проб для внесения в гель из полученного суммарного экстракта брали аликвоты объемом 2 мл. Белки осаждали 50%-ной ТХУ до конечной концентрации 7%, центрифугируя 15 мин при 10000 g. Супернатант отбрасывали и далее работали с осадком. Осадок отмывали от ТХУ в нескольких сменах органических растворителей (этанол, ацетон, эфир). Затем растворяли его в Трис-НС1-бу-фере, pH 6.8, с добавлением сахарозы до 20%, 4.24% Na-ДДС, и 2% Р-меркаптоэтанола, инкубируя в течение 2-3 мин на кипящей водяной бане. Полученные пробы вносили в гель (15 мкл на дорожку). В работе была использована следующая дискретная система: концентрирующий поли-акриламидный гель с концентрацией акриламида 5%, рН 6.8, и разделяющий полиакриламидный
гель с концентрацией акриламида 12.5%, рН 8.8 [17]. Гели окрашивали 0.04%-ным Кумасси бриллиантовым голубым G-250. Перед окрашиванием гели последовательно фиксировали в 45%-ном этаноле в 10%-ной уксусной кислоте, а затем в 25%-ном изопропаноле в 10%-ной уксусной кислоте. После окрашивания гели отмывали и консервировали в 7%-ной уксусной кислоте. Гели калибровали маркерными белками фирмы "Serva" (Германия), использовав бычий сывороточный альбумин (67 кД), овальбумин (45 кД), карбоанги-дразу (29 кД), ингибитор трипсина из сои (21 кД) и цитохром с (12.5 кД),
Реактивы. Трис и Р-меркаптоэтанол были получены от "Fluka" (Швейцария); сахароза, Na-ДДС, акриламид, Кумасси G-250 и поливинил-пирролидон - от "Serva".
Опыты проводили в трех повторностях.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Пыльца - это гаплоидная стадия развития высших растений. Из всех генов, экспрессирующихся в течение ее развития, 10% специфичны для гаме-тофита [18]. Некоторые исследования свидетельствуют о том, что экспрессия генов, ассоциированных с ЦМС, в процессе развития пыльцы носит особенный, отличный от других тканей, характер [8, 13, 14, 19]. Так, при изучении продукта ЦМС-ассоциированного гена orf239 Phaseolus vulgaris обнаружилась его абберантная локализация в каллозном слое, окружающем тетраду, и в первичной клеточной стенке развивающихся микроспор [14]. Авторы предположили, что полученные данные свидетельствуют о роли продукта orf239 в нарушениях правильного формирования клеточной оболочки пыльцевых зерен. Подобная локализация подразумевает транспорт этого белка из митохондрий к периферии клетки [20, 21]. Исходя из всего вышеизложенного, нами было сделано предположение, что в пыльце вероятность обнаружения белковых маркеров для генетической системы ЦМС-Rf выше, чем в других тканях или органах растения.
Полученные в результате проведенного исследования электрофоретические спектры водорастворимых белков оболочки и цитоплазматических белков клеток пыльцевых зерен гибрида Fx и отцовской линии идентичны и содержат 10 полипептидных фракций с мол. м. от 42.5 до 11.2 кД (рис. 1). Специфических белковых фракций, характерных для пыльцы гибрида Fb не установлено. Это может быть объяснено действием генов-восстановителей фертильности, активность которых наблюдается и в пыльце, на протяжении развития, и в пыльниках. Так, в пыльниках гибрида F1 подсолнечника на стадии лептотены мейоза обнаруживается снижение на 74% количества хи-
700
кД 67
45
29 21
12.5
ДУКА, ПОЛИКАРПОВА
кД
67
45
29 21
12.5
кД
-43
-16
М Б,
в
в
Ч
ч
Рис. 1. Электрофореграмма водорастворимых белков оболочки и клеток пыльцевых зерен отцовской линии и гибрида Б,.
М - маркеры, Б, - гибридная форма, Рв - отцовская линия.
мерного 3-кЬ ко-транскрипта аТрА-от/Н522, вследствие влияния продуктов ^/-генов на экспрессию этого участка митохондриального генома, перестроенного в ЦМС генотипе [8, 13].
Следует отметить, что основные различия в наборах цитоплазматических белков были обнаружены для спорофитной ткани (рис. 2). Элект-рофоретические спектры цитоплазматических белков пыльников гибрида Р1, содержащие 8 полипептидных фракции с мол. м. от 48.5 до 11.2 кД, идентичны таковым отцовской линии, за исключением одной специфической фракции с мол. м. 43 кД. Данная фракция, вероятно, характерна для цитоплазмы НеНаМкш ввр. аппыш, так как клетки пыльников материнской линии и гибрида Р1, несущие один и тот же митохондриальный геном, не обнаруживают фракции с аналогичной молекулярной массой.
Электрофоретические спектры цитоплазма-тических белков пыльников материнской линии содержат 6 фракций с мол. м. от 48.5 до 10.5 кД. Как и ожидалось, для пыльников стерильной линии обнар
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.