ГЕНЕТИКА, 2010, том 46, № 6, с. 792-797
ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ
УДК 575.17:597.553.2
ПОИСК И КОНСТРУИРОВАНИЕ ПОПУЛЯЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ SCAR-МАРКЕРОВ для камчатской микижи
Parasalmo (Oncorhynchus) mykiss © 2010 г. М. Н. Мельникова1, С. Д. Павлов1, А. А. Колесников1, Н. Б. Петров2
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, кафедра ихтиологии, Москва 119991; e-mail: sergejavlov@mail.ru 2Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова, Москва 119899
Поступила в редакцию 25.12.2008 г.
Проанализирован геном различных популяций камчатской микижи (Parasalmo (O.) mykiss) AP-PCR-методом. Полиморфные участки, предполагающие географические различия между выборками, были отобраны, клонированы и секвенированы. На основе полученных нуклеотидных последовательностей были отобраны и сконструированы более длинные специфичные SCAR-праймеры. Последовательности проанализированы программой "BLAST" на аналогию с последовательностями, имеющимися в генетическом банке. Вероятнее всего, все они принадлежат к ранее неизученным повторяющимся последовательностям, которые варьируют в популяциях данного вида. Были созданы семь SCAR-маркеров, имеющих популяционно-значимую вариабельность ДНК-продуктов у камчатской географической группы микижи, что может быть использовано в дальнейших исследованиях вида Parasalmo (O.) mykiss. Последовательности SCAR-маркеров были помещены в GeneBank под номерами EU805500—EU805506.
Камчатская микижа Рага$а1то (Опеогкупект) туШзз является сложным полиморфным видом, представляющим значительный интерес для изучения процессов видообразования и механизмов микроэволюции.
Первоначально для выяснения и описания внутривидовой структуры камчатской микижи использовались морфологические (фенотипиче-ские) признаки [1—4], однако маркеры этого типа не позволяют выявить популяционно-генетиче-ские отношения внутри этого вида в силу недостаточной разрешающей силы и ограниченности их количества. Развитие молекулярных методов исследований привело к созданию тест-систем, позволивших анализировать генетический полиморфизм на уровне продуктов генома (биохимические маркеры) и на уровне генетического материала клетки (ДНК-маркеры).
В ходе исследований выяснились ограничения в применении биохимических маркеров, поскольку анализ белков позволяет исследовать полиморфизм только экспрессирующихся белок-кодирующих генов, составляющих всего около 1% генома высших эукариот. Так, исследования ал-лозимной изменчивости разных популяций Рагаза1-то (О.) туШзз выявили гораздо меньший уровень полиморфизма по сравнению с уровнем разнообразия морфологических форм этого вида [5, 6].
Более перспективным представляется анализ на уровне генетического материала клетки. В ли-
тературе представлено немало статей, посвященных генетической дифференциации американской группы популяций микижи [7—11]. Нами были проведены исследования по применению "американских" маркеров для оценки внутривидовой изменчивости камчатской географической группы РагазаЫо (О.) туШзз, первые результаты которых описаны в предыдущей работе [12].
Рестриктный анализ и секвенирование фрагментов мтДНК (гены аугЪ, ЫБ/3, N0/4, ЛТР6, ЛТ¥8, части Э-1оор) показали низкий уровень вариабельности митохондриальной ДНК у камчатских популяций микижи, по сравнению с американскими, и оказались неперспективными для дальнейших исследований популяционного уровня. Анализ генетической изменчивости ядерной ДНК, включающий в себя секвенирование спейсеров рибосомальной ДНК и рестриктный анализ мелкощепящими эндонуклеазами генов гормона роста I и II, обнаружил единичные мутации. Стало очевидно, что большинство вариабельных участков генома, выявленных у американских форелей и других близкородственных организмов, не показывают достаточной популя-ционной изменчивости в применении к монофи-летичной камчатской группе РагазаЫо (О.) туШзз.
Более перспективным оказалось использование в качестве маркерных систем полиморфных последовательностей ДНК, которые могут нахо-
диться как в кодирующей, так и в некодирующей части генома.
Одним из широко известных методов поиска вариабельных участков ДНК является RAPD-ме-тод (Randomly Amplyfied Polymorphie DNA) — метод ПЦР e использованием короткого случайного праймера [13, 14] или его модификация AP-PCR с двумя праймерами [15]. Праймеры могут быть разной длины, температура отжига подбирается в зависимости от их структуры. Этот метод технически прост в использовании, эффективен и достаточно дешев. По электрофоретическим паттернам продуктов реакции можно регистрировать различия между геномами близкородственных организмов в большом числе локусов по всему геному в целом. Большинство RAPD-маркеров являются доминантными. Однако RAPD-анализ имеет низкую воспроизводимость результатов, обусловленную повышенной чувствительностью к условиям реакции, и выявляет анонимные участки генома неизвестной природы [16].
SCAR-маркеры (Sequence Chаracterized Amplyfied Region — "охарактеризованный секвени-рованием амплифицированный район") [17], берущие начало от полиморфных RAPD-маркеров, лишены большинства таких недостатков и применимы для разнообразных исследований. Для получения локус-специфичных маркеров интересующий фрагмент экстрагируют из геля, клонируют и секвенируют. На основе полученной нук-леотидной последовательности подбирают длинные высокоспецифичные праймеры, которые амплифицируют единичный фрагмент с высокой степенью воспроизводимости. Многие из них ко-доминантны и могут быть использованы как уникальные маркеры для паспортизации генотипов. В литературе представлены данные по подбору таких маркеров для калифорнийской форели [18] и других рыб [19].
В данной работе произведены поиск полиморфных AP-PCR-фрагментов для разных популяций камчатской микижи и конструирование на их основе SCAR-маркеров.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материал был собран от разных форм Parasal-mo (O.) mykiss, обитающих в наиболее крупных реках и водных бассейнах Камчатки, близ Шан-тарских островов, а также американских популяций. Учитывая, что данный вид представлен разными эпигенетическими вариациями, в анализ были включены особи речной (резидентной) и проходной форм. Принадлежность к той или иной форме подтверждалась анализом чешуи и содержанием Sr/Ca в отолитах. Всего было исследовано семь популяций Parasalmo (O.) mykiss (речная и проходная формы из р. Сопочная западного
побережья Камчатки, речная форма с восточного побережья, микижа с Шантарских островов, промысловая форма из Охотского моря; в качестве репера были взяты образцы североамериканской микижи: прибрежной — coastal-форма и материковой — inland-форма).
Тотальную ДНК выделяли из замороженной мышечной ткани стандартным методом, включающим гомогенизацию материала с буфером Net 25 (100 мМ NaCl, 20 мМ трис-HC pH 7.5-8.0, 25 мМ EDTA), лизис клеток 3%-ным саркозилом Na, инкубацию лизата с протеиназой К (100 мкг/мл) в течение 3 ч при 60°С и депротеинизацию смесью фенол-хлороформ (1 : 1) и смесью хлороформ— изоамиловый спирт (24 : 1).
Реакцию амплификации для определения AP-PCR-маркеров проводили в объеме 25 мкл 0.01 М буфера трис-HCl, pH 8.3, содержащего 0.05 М KCl, смесь четырех dNTP (0.1—0.2 мМ), MgCl2 (5 мМ), два случайных праймера в разных сочетаниях, по 2 ед. на пробу Та#-ДНК-полимеразы, содержащей моноклональные антитела для "горячего старта" (SmartTaq, "Диалат", Россия), и 100 нг исследуемой ДНК. Были поставлены необходимые контроли на чистоту праймеров от матриц и чистоту матриц от праймеров (реакционные смеси не содержали либо ДНК, либо праймеров). Полимеразную реакцию проводили по двум сцепленным программам: "горячий старт" 94°С — 5 мин, первая программа — (94°С — 42 с, 50°С — 30 с, 72°С — 30 с) х 3 цикла; вторая программа — (94°С — 42 с, 60°С — 30 с, 72°С — 30 с) х 32 цикла. Реакцию многократно проверяли на воспроизводимость. В качестве случайных праймеров использовали олигонуклеотиды с произвольной последовательностью, любезно предоставленные фирмой "Синтол", Россия.
Электрофоретическое разделение продуктов реакции проводили в горизонтальном агарозном геле (GenePure LE, "BioExpress") в ТВЕ-буфере при напряжении 60 В в течение пяти часов. Гель окрашивали 0.05%-ным бромистым этидием, промывали водой, просматривали в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе и фотографировали цифровой видеокамерой c использованием светофильтра ОС-12 (оранжевый спектр).
В качестве маркеров молекулярной массы использовали 1 kb "Ladder" фирмы "СибЭнзим", Россия.
Полиморфные AP-PCR-фрагменты после вырезания из геля элюировали и очищали с использованием фирменного набора QIAquick Gel Extraction Kit ("Qiagen"). Элюированный фрагмент клонировали с использованием набора pGEM-T vector system II ("Promega") согласно протоколу производителя. После трансформации из реком-бинантных клонов выделяли плазмидную ДНК, проверяли на наличие клонированных фрагмен-
Таблица 1. Нуклеотидные последовательности прайме-ров, использованных в анализе AP-PCR ДНК микижи
Порядковый № праймера Последовательность 5'—3' Длина в нуклеотидах
1 tgg cct ggc tgc cct gag cag 21
2 gat cat gcc att gca ctc ta 20
3 atg ctt tgg wac aca cct tcg t 22
4 gag gat tgt ggc ctt ctt tg 20
5 taa tac gac tca cta tag gg 20
6 gca cat tt acg att cct agt gg 20
Таблица 2. Сочетания олигонуклеотидов, использованных в анализе АР-РСЯ ДНК микижи, и длины фрагментов, использованные в дальнейшем анализе
Сочетание праймеров Приблизительные длины исследуемых далее фрагментов, пн
1 + 2 500
2 + 3 400
4 + 2 500; 600
4 + 5 200
4 + 6 300; 400 и 500
тов и секвенировали с двух концов, используя универсальные праймеры. Секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator V.3.1 с последую-
SPSH SPRB ZHRB shant Semga M
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
2000 1500
„ . ^^ -' *- 4'
1000 750
Фрагмент, предназначенный для вырезания из геля и дальнейших исследований
Рис. 1. Пример полиморфного AP-PCR-профиля для Parasalmo (Oncorhynchus) mykiss. SPSH (1—4), SPRB (
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.