ИЗВЕСТИЯ АН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2008, № 3, с. 324-332
ФИЗИОЛОГИЯ животных И ЧЕЛОВЕКА
УДК 616.153.455.04:577.11
ПОКАЗАТЕЛИ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО И АЗОТИСТОГО ОБМЕНА У КРЫС ПРИ ИНСУЛИНОВОЙ ГИПОГЛИКЕМИИ
© 2008 г. П. К. Телушкин*, А. Д. Ноздрачев*, П. П. Потапов**
* Санкт-Петербургский государственный университет, 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб., 7 ** Ярославская государственная медицинская академия, 150000 Ярославль, ул. Революционная, 5
Поступила в редакцию 26.05.2006 г
Неоднократно перенесенная тяжелая инсулиновая гипогликемия у крыс приводила к увеличению активности аминотрансфераз, глутаминазы и глутаматдегидрогеназы в печени, увеличению активности протеаз в тканях, увеличению уровня свободных жирных кислот, мочевины и мочевой кислоты в сыворотке крови. Обнаруженные изменения свидетельствовали об активации глюконеогенеза у животных, подвергнутых гиперинсулинизации. В головном мозге наблюдали уменьшение интенсивности гликолиза и гликогенолиза, активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ и существенные изменения активности ферментов нуклеотидного обмена и обмена медиаторных аминокислот. Выявленные изменения были преимущественно связаны с гипогликемией и активацией контринсуляр-ного аппарата и могли иметь существенное значение в патогенезе постгипогликемической энцефалопатии.
Глюкоза является основным пластическим и энергетическим субстратом в нервной ткани (Ames, 2000). Гипогликемия приводит к гибели нейронов, нарушению функции мозга и развитию постгипогликемической энцефалопатии, патохи-мия которой требует изучения (Auer, 1986; Телушкин, Ноздрачев, 1999). Практически важно, что гипогликемия является основным осложнением инсулинотерапии сахарного диабета и в процессе лечения пациентов с сахарным диабетом, а также при инсуломе поджелудочной железы наблюдается неоднократно (Amiel, 1996; Bolli, Fanelli, 1999; Marks, Teale, 1999; Балаболкин, 2000; Inouye et al., 2002; Cryer et al., 2003). Возможные нарушения обмена в мозге и в организме в целом при неоднократной гипогликемии исследованы недостаточно. Изменения биохимических показателей при введении высоких доз инсулина являются результатом гиперинсулинемии, гипогликемии и активации контринсулярного аппарата (Amiel, 1996; Bolli, Fanelli, 1999; Балаболкин, 2000). Разнонаправленные регуляторные влияния могут вызывать серьезные нарушения мобилизации и утилизации энергетически важных субстратов. Вероятность развития таких нарушений увеличивается при неоднократном воздействии. Метаболический стресс, связанный с предшествующими эпизодами гипогликемии, может создавать неблагоприятный метаболический фон для протекания последующих гипогликемических состояний.
В работе проведено исследование показателей энергетического и азотистого обмена в головном мозге и печени у крыс при одно- и многократном
введении высоких доз инсулина, вызывающих ги-погликемическую кому.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Опыты выполнены на белых беспородных крысах самцах массой 200-240 г. Все животные содержались на стандартном пищевом рационе и перед каждым опытом были лишены пищи течение 18-24 ч. Животные были разделены на 5 групп: 1 -интактные животные (контроль); 2 - крысы, находящиеся в состоянии гипогликемической комы (ГГК); 3 - животные, обследованные через 48 ч после купирования ГГК; 4 - крысы, перенесшие 7 ГГК с интервалом в двое суток и забитые во время последней из серии ком; 5 - крысы, перенесшие 7 ГГК и забитые через 48 ч после купирования последней комы. ГГК (утрата постураль-ных рефлексов, содержание глюкозы в крови около 1.0-2.0 ммоль/л) вызывали внутримышечной инъекцией инсулина в дозе 40 ЕД/кг массы, купирование проводили введением коматозным животным 3 мл 40%-ного раствора глюкозы в желудок. После купирования комы крысы находились в условиях свободного доступа к пище в течение суток; воду получали без ограничения при всех условиях эксперимента.
В крови определяли концентрацию глюкозы (Прохорова, 1982), а в сыворотке крови содержание кетоновых тел (Тодоров, 1961), свободных жирных кислот (СЖК), мочевины и мочевой кислоты (Меньшиков, 1987).
В больших полушариях мозга (БПМ) и стволе мозга (СМ), а также в печени и скелетных мыш-
Таблица 1. Содержание энергетических субстратов, продуктов азотистого обмена в крови и гликогена в органах крыс при гиперинсулинизации (М ± т)
Показатель Группа
1 2 3 4 5
Глюкоза, ммоль/л 5.37 ± 0.12 1.36 ± 0.14*** 5.63 ± 0.17 1.76 ± 0.23*** 5.47 ± 0.15
СЖК, мкмоль/л 409 ± 15 235 ± 34*** 125 ± 11*** 501±13*** 245 ±16***
Кетоновые тела, мг/л 34.8 ± 1.6 18.6 ± 2.3*** 13.1 ± 2.0*** 36.9 ± 2.5 25.7 ± 1.0***
Мочевина, ммоль/л 4.6 ± 0.8 4.6 ± 0.2 2.9 ± 0.3** 7.5 ± 0.4*** 4.4 ± 0.7
Мочевая кислота, мкмоль/л 210 ± 4 168±3** 245 ± 5** 244 ±14* 250 ±10*
Гликоген печени, мг/г 25.9 ± 1.6 17.1 ± 1.8** 49.3 ± 2.5*** 26.7 ±± 1.3 25.5 ± 1.7
Гликоген БПМ, мг/г 1.32 ± 0.08 0.59 ± 0.10** 1.39 ± 0.10 1.10 ± 0.09 1.28 ± 0.04
Гликоген СМ, мг/г 1.47 ± 0.06 0.80 ± 0.12** 1.45 ± 0.07 1.23 ± 0.11 1.56 ± 0.05
Гликоген скелетных мышц, мг/г 9.5 ± 0.6 5.6 ± 0.4*** 14.7 ± 0.5*** 11.2 ± 0.9 13.0 ± 1.9
Примечание. М - среднее, т - ошибка среднего; в каждой группе по 6-8 животных. БПМ - большие полушария мозга, СМ -ствол мозга. Статистически достоверные по сравнению с контролем изменения обозначены: * р < 0.05. ** р < 0.01. *** р < 0.001. Для табл. 1-5.
цах (мышцы медиальной поверхности бедра) определяли уровень гликогена (Прохорова, 1982).
Интенсивность гликолиза и гликогенолиза в головном мозге и печени исследовали по скорости накопления лактата в инкубационной среде, используя в качестве субстратов глюкозу, глюкозо-6-фосфат (Г6Ф) и гликоген (Панин и др., 1982). Активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ, КФ 1.1.1.27), сукцинатдегидрогеназы (СДГ, КФ 1.3.99.1), глута-матдегидрогеназы (ГДГ, КФ 1.4.1.3), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6Ф-ДГ, КФ 1.1.1.49), глу-татионредуктазы (ГР, КФ 1.6.4.2), НАДФ-изоцит-ратдегидрогеназы (НАДФ-ИЦДГ, КФ 1.1.1.42), НАДФ-малатдегидрогеназы (НАДФ-МДГ, КФ 1.1.1.40), аспартатаминотрансферазы (АСТ, КФ
2.6.1.1) и аланинаминотрансферазы (АЛТ, КФ
2.6.1.2) определяли спектрофотометрически (Прохорова, 1982). Активность глутаминазы (ГЛТ, КФ 3.5.1.2) и аденозинмонофосфатдезаминазы (АМФ-Д, КФ 3.5.4.6) оценивали по накоплению аммиака (Телушкин и др., 2001). Для печени активности ГДГ, СДГ, ГЛТ, АМФ-Д и аминотрансфераз определяли в 10%-ном гомогенате ткани, для головного мозга - в суммарной фракции митохондрий, полученных методом дифференциального центрифугирования (Прохорова, 1982). Интенсивность гликолиза и активности ЛДГ, Г6Ф-ДГ, ГР, НАДФ-ИЦДГ и НАДФ-МДГ в головном мозге и печени исследовали в супернатанте, полученном после центрифугирования 10%-ного гомогената при 14000 g в течение 15 мин. Активность нейтральных и кислых протеаз в гомогенатах мозга, печени и скелетных мышц определяли соответственно
при рН 7.6 и рН 3.2 по накоплению тирозина, используя в качестве субстрата денатурированный мочевиной гемоглобин (Мурти и др., 1985).
Количество белка определяли по Лоури. Статистическую обработку проводили с применением ¿-критерия Стъюдента. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Содержание глюкозы в крови у крыс в состоянии 1-й и 7-й ГГК было практически одинаковым (табл. 1). У крыс 4-й группы концентрация СЖК в сыворотке крови увеличивалась на 22%, (р < < 0.001), а уровень кетоновых тел не отличался от нормы. У животных остальных экспериментальных групп оба показателя были значительно снижены. Содержание мочевины в сыворотке крови в состоянии первой ГГК оставалось нормальным, а через 48 ч после купирования уменьшалось на 37% (р < 0.01). У крыс, перенесших серию ГГК, в состоянии последней комы уровень мочевины значительно повышен (на 63%, р < 0.001). Концентрация мочевой кислоты в сыворотке уменьшалась на 20% (р < 0.01) у животных в состоянии первой ГГК и увеличивалась на 17% (р < 0.01) через 48 ч после купирования. У крыс 4-й группы показатель повышен на 16% (р < 0.01) по сравнению с нормой и оставался высоким через 48 ч после купирования последней комы.
Количество гликогена в печени и скелетной мышце крыс в состоянии первой ГГК было снижено соответственно на 25% и 41%, а через 48 ч
Таблица 2. Интенсивность накопления лактата в печени и головном мозге крыс при гиперинсулинизации, нмоль/(мин мг белка) (М ± т)
Субстрат Группа
1 2 3 4 5
Глюкоза Г6Ф
Гликоген
Глюкоза Г6Ф
Гликоген
12.7 ± 1.2
23.2 ± 1.4
17.3 ± 1.0
53.6 ± 1.1 66.1 ± 4.0
19.8 ± 2.1
Печень
12.3 ± 1.1 21.2 ± 1.8 11.6 ± 1.1**
55.1 ± 1.0
63.6 ± 2.1 20.1 ± 1.6
БПМ
12.1 ± 1.4 24.6 ± 1.7
18.1 ± 0.9
55.4 ± 1.2 64.9 ± 2.8 21.1 ± 1.7
СМ
19.0 ± 0.8** 25.4 ± 2.0 26.6 ± 0.6***
40.0 ± 2.1*** 25.8 ± 0.6*** 10.3 ± 2.0*
14.2 ± 1.4 27.8 ± 1.3 16.8 ± 2.1
56.1 ± 1.1 65.8 ± 2.5 18.7 ± 2.1
Глюкоза 57.6 ± 1.0 55.7 ± 1.1 55.1 ± 1.4 37.4 ± 1.6*** 57.4 ± 1.3
Г6Ф 73.7 ± 5.5 67.4 ± 4.0 69.7 ± 3.4 28.3 ± 2.6*** 68.3 ± 3.1
Гликоген 18.7 ± 1.5 21.3 ± 1.2 19.5 ± 0.9 11.4 ± 0.8*** 14.4 ± 0.9*
после купирования комы значительно увеличивалось (во всех случаях р < 0.05) по сравнению с контролем. У животных 4-й и 5-й групп изменений уровня полисахарида в печени и мышце не выявлено. Количество гликогена в БПМ и СМ у крыс (табл. 1) в состоянии однократной ГГК уменьшалось соответственно на 55% и 45% (в обоих случаях р < 0.01) и не отличалось от уровня контроля у животных других групп.
Скорость образования лактата в печени у крыс в состоянии первой ГГК при использовании в качестве субстратов глюкозы и Г6Ф не изменялась, а интенсивность гликогенолиза снижалась на 33% (р < 0.01) по сравнению с контролем (табл. 2). У животных 4-й группы интенсивность накопления лактата при использовании глюкозы и гликогена в качестве исходных субстратов увеличивалась в 1.5 раза (в обоих случаях р < 0.01), изменений скорости накопления лактата при использовании в качестве субстрата Г6Ф не выявлено. В период реадаптации после ГГК в печени не обнаружено существенных различий интенсивности гликолиза и гликогенолиза по сравнению с контролем.
У животных
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.