НЕИРОХИМИЯ, 2011, том 28, № 1, с. 83-86
КРАТКИЕ ^^^^^^^^^^^^^^^^ СООБЩЕНИЯ
УДК 612.8
ПОКАЗАТЕЛИ НИТРОЗАТИВНОГО СТРЕССА И ИММУННОГО ОТВЕТА В ЛИКВОРЕ БОЛЬНЫХ НА РАННЕЙ СТАДИИ ИНСУЛЬТА
© 2011 г. М. В. Онуфриев1, *, И. В. Савоськина1, И. Л. Каймовский2, A. В. Лебедева 2,
E. И. Гусев2, ^ Б. Гехт2, Н. В. Гуляева1
Учреждение Российской академии наук Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва 2Российский государственный медицинский университет, Москва
Исследовано содержание продуктов нитрозативного стресса, иммуноглобулинов и аутоантител к нитрованным белкам в ликворе больных в первые сутки после наступления инсульта. Уровень метаболитов оксида азота, нитратов и нитритов достоверно увеличился в ликворе только после ише-мического инсульта. Активность МО-синтазы и выход лактатдегидрогеназы в ликвор после геморрагического инсульта существенно превышали таковые после ишемического инсульта и в контрольной группе. В ликворе больных достоверно возросло содержание иммуноглобулинов (1§) классов G, М и А, причем в группе с геморрагическим инсультом прирост этих классов существенно преобладал над остальными группами. Связывание нитротирозин-БСА статистически значимо возрастало в ликворе больных с инсультом обоих типов. Таким образом, структурные модификации белков в результате нитрозативного стресса стимулируют иммунный ответ, выявляемый в ликворе на ранней стадии инсульта.
Ключевые слова: оксид азота, нитротирозин, аутоантитела, нитрозативный стресс, инсульт.
Нитрозативный стресс, как и окислительный стресс, характеризуется дисбалансом между уровнями окислителей и антиоксидантов. NO реагирует с супероксидным анионом с образованием сильного окислителя пероксинитрита, который участвует в нитровании остатков тирозина в белках [1]. Ней-рональная NO-синтаза ^NOC) играет доминирующую роль в образовании нитротирозина в мозге на ранних стадиях ишемии и реперфузии, а на поздних стадиях ишемии образование пероксинитрита полностью зависит от экспрессии индуцибельной NOC ^NOC) [2, 3].
Присутствие нитрованных белков и пептидов может активировать иммунную систему и продукцию иммуноглобулинов, специфически распознающих нитротирозин [4]. Анализ ликвора позволяет выявлять не только продукты нитрозативного и окислительного стресса, но и иммунную реакцию в ЦНС [5]. Так, в ликворе больных обнаружено увеличение содержания аутоантител к основному белку миелина через сутки после ишемического инсульта [6].
Целью настоящей работы явилось выявление показателей нитрозативного стреса и иммунной реакции на нитрованные белки в ликворе больных в раннем периоде инсульта.
* Адресат для корреспонденции: 117485 Москва, ул. Бутлерова, 5а, e-mail: mikeonuf1@rambler.ru.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Больным, поступившим в отделение реанимации и интенсивной терапии ГКБ №1 им. Н.И. Пирогова с диагнозом острое нарушение мозгового кровообращения (инсульт), проводилась спинномозговая пункция и забор 2—3 мл ликвора в первые сутки от начала инсульта. В контрольную группу вошли "неврологически здоровые" пациенты, находившиеся в травматологическом отделении. Ликвор у этих пациентов отбирали в момент проведения эпиду-ральной анестезии при операциях на нижних конечностях. Пациенты контрольной группы были сопоставимы по полу и возрасту с основной группой больных. Полученный ликвор центрифугировали для удаления клеток, аликвотировали и хранили до анализа при температуре —80°С.
Суммарную концентрацию стабильных метаболитов оксида азота — нитратов и нитритов (N O-) в ликворе определяли флюориметрическим методом с использованием 2,3-диаминонафталина [7]. Атив-ность NOC определяли радиометрическим методом [8] c модификациями [9]. Определение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) осуществляли флюориметрическим методом [10]. Содержание иммуноглобулинов определяли с помощью им-муноферментного анализа (ИФА) с использованием поликлональных антител к человеческим иммуноглобулинам ("Имтек", Россия). Связывание нитротирозин-БСА ("Саутап Chemical Company",
83
6*
84 ОНУФРИЕВ и др.
Содержание NOx, активность NOC и ЛДГ в ликворе больных после инсульта
Группа Показатель
NOx (нмоль/мл) NOC (имп/мин) ЛДГ (нмоль НАДН/мин)
Контроль(n =10) 3.0 ± 0.64 27.3 ± 27.3 5.70 ± 0.60
Ишемический инсульт (n = 14) 7.36 ± 1.71* 478 ± 247* 5.38 ± 1.05
Геморрагический инсульт (n = 11) 2.12 ± 0.39 2137 ±603** 8.96 ± 0.13*
Примечание. * — достоверные отличия от контроля приp < 0.05; ** — приp < 0.01.
США) с белками ликвора оценивали методом ИФА с использованием моноклональных антител к нит-ротирозину ("Cayman Chemical Company", США).
Данные представлены в виде M ± SEM. Достоверность различий между группами оценивали при помощи i-критерия Стьюдента.
Хемилюминесценция, у.е. 600000
500000 400000 300000 200000 100000 0
# **
Хемилюминесценция, у.е. 600000
500000 400000 300000 200000 100000 0
Контроль Ишемический Геморрагический инсульт инсульт
Хемилюминесценция, у.е. 600000
500000 400000 300000 200000 100000 0
# **
# **
Контроль Ишемический Геморрагический инсульт инсульт
Контроль
Ишемический Геморрагический инсульт инсульт
Рис. 1. Содержание иммуноглобулинов классов G (а), М (б) и А (в) в ликворе больных после инсульта.
* — р < 0.05; ** — р < 0.01; + — р < 0.1; отличия от контроля,
# — р < 0.05; различия между группами ишемический инсульт — геморрагический инсульт.
*
+
в
ПОКАЗАТЕЛИ НИТРОЗАТИВНОГО СТРЕССА И ИММУННОГО ОТВЕТА
85
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В ликворе больных после ишемического инсульта содержание N0^ увеличилось более, чем в 2 раза, тогда как после геморрагического инсульта достоверных отличий от контрольных значений по этому показателю не выявлено (таблица). Увеличение содержания N0^ в ликворе больных после ишемического инсульта соответствует данным литературы как для экспериментальных животных на модели фокальной ишемии мозга, так и для больных инсультом [11, 12]. Среди немногочисленных исследований продукции метаболитов N0 после геморрагического инсульта в течение первых 24 ч отмечают повышение уровня N0^ в ликворе больных [13, 14]. Однако в наших исследованиях содержание N0^ не отличалось от контрольного уровня. По-видимому, решающее значение имеет локализация и объем гематомы, поскольку известно, что гемоглобин обладает высоким сродством к N0 и может быть его перехватчиком, снижая концентрацию метаболитов N0 в мозге [15].
Активность N0C возросла практически на 2 порядка при геморрагическом инсульте и в меньшей (но существенной) степени увеличилась в ликворе от больных ишемическим инсультом. Активность ЛДГ не отличалась от контрольного уровня в случае ишемического инсульта и увеличилась достоверно в 1.5 раза при геморрагическом инсульте (таблица). Следует отметить, что нами впервые показано увеличение активности N0C в ликворе после инсульта. Ранее Са1аЪезе й а1. [16] выявили активность иN0C в ликворе больных рассеянным склерозом. По-видимому, такая активность может относиться как к секретированной иN0C из активированных астроцитов и/или микроглии, так и к другим изо-формам N0^ происходящим из разрушенных клеток. В пользу последнего предположения свидетельствует повышенная активность ЛДГ в ликворе больных геморрагическим, но не ишемическим инсультом.
В ликворе больных инсультом обоих типов выявлено повышенное содержание Ig G, М и А (рис. 1а, б, в), причем более выраженное увеличение наблюдалось в группе с геморрагическим инсультом. Связывание нитротирозин-БСА исходно присутствовало в контрольной группе, достоверно увеличилось в ликворе после ишемического инсульта и достоверно превышало значения в группах контроль и ишемический инсульт в ликворе больных геморрагическим инсультом (рис. 2).
Можно предположить, что повышение связывания нитротирозин-БСА ликвором происходило благодаря увеличению продукции Видимо, это свидетельствует о выработке аутоантител
Хемилюминесценция, у.е. 100000
80000
60000
40000
20000
# **
if
Щ 1 ¡бббоб
Контроль Ишемический Геморрагический инсульт инсульт
Рис. 2. Связывание нитротирозин-БСА ликвором больных с инсультом.
* — p < 0.05; ** — p < 0.01; отличия от контроля,
# — p < 0.01; различия между группами ишемический инсульт — геморрагический инсульт.
к нитрованным белкам, которые образовались в результате нитрозативного стресса, индуцированного инсультом.
Работа поддержана РФФИ, грант № 08-04-00870-а.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Gow A., Duran D., Malcolm S., Ischiropoulos H. // FEBS Lett. 1996. V. 385. P. 63-66.
2. Eliasson M, HuangZ., Ferrante R., Sasamata M, Mol-liver M., Snyder S, Moskowitz M. // J. Neurosci. 1999. V. 19. V. 5910-5918.
3. Hirabayashi H., Takizawa S., Fukuyama N., Nakazawa H., Shinohara Y. // Brain Res. 2000. V. 852. P. 319-325.
4. Ischiropoulos H. // Arch. Biochem. Biophys. 2009. V. 484. P. 117-121.
5. Regeniter A., Kuhle J., Mehling M, Moller H., WursterU, Freidank H., Siede W. // Clin. Neurol. Neurosurg. 2009. V. 111. P. 313-318.
6. Жданов Т.Н., Герасимова М.М. // Неврологический журнал. 2005. Т. 10. № 1. С. 19-21.
7. Misko T., Schilling R., Salvemini D., Moore W., CurrieM. // Anal. Biochem. 1993. V. 214. P. 11-16.
8. Bredt D., Snyder S. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 9030-9033.
9. Онуфриев М.В.,Степаничев М.Ю., Митрохина О.С., Моисеева Ю.В., Лазарева Н.А., Гуляева Н.В. // Рос. физиол. журн. 1999. Т. 85. С. 531-538.
10. Kosenko E., Montoliu C., Giordan, G. // J. Neurochem. 2004. V. 89. P. 1101-1110.
0
86
ОНУФРИЕВ и др.
11. Xu L, Wang B, Kaur K., Kho M, Cooke J, Giffard R. // Neurosci Lett. 2007. V. 418. P. 201-204.
12. Krupinski J., Vodovotz Y., Li C., Slowik A., Beevers D, Flanders K., Lip G, Kumar P., Szczudlik A. // Nitric Oxide. 1998. V. 2. P. 442-453.
13. Sadamitsu D, Kuroda Y, Nagamitsu T. // Critical Care Medicine. 2001. V. 29. P. 77-79.
14. Petzold A., Rejdak K., Belli A., Sen J., Keir G, Kitchen N., Smith M, Thompson E. // J. Neurotrauma. 2005. V. 22. P. 407-414.
15. Sehba F, Schwartz A., Chereshnev I., Bederson J. // J. Cereb. Blood Flow Metab. 2000. V. 20. P. 604-611.
16. Calabrese V., Scapagnini G, Ravagna A., Bella R., Foresti R.,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.