ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2015, том 70, № 11, с. 1186-1190
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 543.94:543.55:543.38
ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫЕ МИКРОКАПСУЛЫ С УРЕАЗОЙ И ПАРАМАГНИТНЫМИ ЧАСТИЦАМИ КАК ОСНОВА ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКОГО БИОСЕНСОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЧЕВИНЫ
© 2015 г. А. Н. Решетилов*, Ю. В. Плеханова*, 1, С. А. Тихоненко**, А. В. Дубровский**
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук 149290Московская обл., Пущино, просп. Науки, 5 1Е-таИ: yulia-plekhanova@rambler.ru **Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук 149290Московская обл., Пущино, ул. Институтская, 3 Поступила в редакцию 18.11.2014 г., после доработки 15.04.2015 г.
Предложен биосенсор на основе рН-чувствительного полевого транзистора для детектирования мочевины. В качестве биорецептора использовали полиэлектролитные микрокапсулы (размер 3—4 мкм) со встроенными парамагнитными частицами Бе304 и ферментом уреазой, способным к биотрансформации мочевины. Биорецептор формировали на поверхности затвора транзистора с помощью постоянного магнитного поля; осаждение микрокапсул на затворной зоне происходило за счет наличия в биорецепторе парамагнитных частиц. Микрокапсулы готовили отдельно и хранили при 4°С. Данный способ формирования биосенсора занимает несколько секунд и не требует дополнительных химических реагентов для обработки поверхности электрода до и после измерения. Нижний предел детектирования мочевины составляет 0.03 мМ в диапазоне 0.03—100 мМ. Биосенсор имеет высокую чувствительность (~3.58 рН/мМ) и время формирования сигнала порядка 30—150 с в зависимости от концентрации мочевины. Биосенсор апробирован на образцах молока.
Ключевые слова: уреаза, рН-чувствительный полевой транзистор, полиэлектролитные микрокапсулы, парамагнитные частицы, мочевина, биосенсор.
БО1: 10.7868/80044450215110146
Ферментные биосенсоры на основе ионселек-тивных полевых транзисторов (ПТ) являются высокоселективными, чувствительными, простыми в исполнении, быстрыми и достаточно дешевыми аналитическими приборами для определения различных веществ [1, 2]. Такие биосенсоры находят применение во многих областях человеческой деятельности — в медицине, биотехнологии, контроле окружающей среды, сельском хозяйстве, пищевой промышленности [3—5].
Большое внимание при создании ферментных биосенсоров на основе ПТ уделяется методам иммобилизации фермента на поверхности преобразователя и долговременной стабильности работы. Как правило, иммобилизация фермента на поверхности электрода предполагает обработку поверхности электрода определенными реактивами для иммобилизации фермента и последующую регенерацию поверхности после измерения с использованием других реактивов. Такие процедуры занимают время от 30 мин [6] до суток [4] и мо-
гут приводить к повреждениям поверхности электрода. Один из способов, который помог бы избежать подобных процедур, связан с использованием магнитных частиц для иммобилизации фермента и их последующего осаждения с помощью постоянного магнитного поля на поверхности измерительного электрода. Так в работе [7] фермент липазу иммобилизовали на магнитных наночастицах (феррит никеля) и применяли постоянный магнит для фиксации их на затворе ПТ; такой биосенсор использовали для оценки концентрации триглицеридов.
Ранее показано [8], что использование капсу-лирования ферментов в полиэлектролитные матрицы позволяет сохранять активность фермента на высоком уровне в течение нескольких месяцев. После включения в капсулу также повышается длительность хранения, устойчивость фермента к агрессивным средам [9]. Капсулирование ферментов применяли в моделях потенциометри-ческих биосенсоров для детектирования мочеви-
ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫЕ МИКРОКАПСУЛЫ
1187
(а)
(б)
Электрод сравнения
Мочевина
ПСС/ПАА/ПСС Fe3O4 ПСС, ПАА
Микросферолиты CaCO3—уреаза
Полиэлектролитные микрокапсулы с уреазой и парамагнитными частицами Fe3O4
Исток
Сток
Подложка p-типа
N
S
Затворный диэлектрик $Ю2/Та205
Рис. 1. Схематическое изображение процесса формирования микрокапсул с уреазой и парамагнитными частицами (а) и иммобилизации биорецептора на поверхности полевого транзистора с помощью постоянного магнитного поля (б).
ны на основе стеклянного рН-электрода [10] и рН-чувствительного полевого транзистора [11]. Объединение капсулирования фермента и использования магнитных частиц позволяет сократить и упростить как процедуру создания биосенсора, так и время анализа.
Цель данной работы — создание биосенсора на основе полиэлектролитных микрокапсул со встроенным ферментом уреазой и парамагнитными на-ночастицами Fe3O4 и исследование параметров созданного биосенсора. Микрокапсулы осаждали на затворной поверхности рН-чувствительного ПТ при помощи постоянного магнитного поля. Полученный биосенсор использовали для определения мочевины в модельных и реальных образцах.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы и реагенты. Использовали уреазу (КФ 3.5.1.5) из Canavalia ensiformis (Jack bean) (активность 104 ед./мг) (Fluka, США); мочевину (Химреактив, Россия); полистиролсульфонат натрия (ПСС, 70 кДа) и полиаллиламингидрохлорид (ПАА, 70 кДа) (Aldrich, Germany); этилендиамин-тетрауксусную кислоту (ЭДТА) (Sigma, Germany); CaCl2, Na2CO3 (Реахим, Россия); NaOH, KH2PO4, NaCl (ООО "Окабиолаб", Россия); парамагнитные частицы Fe3O4 (~1 мкм) (ООО "ИзоГель", Россия). Постоянное магнитное поля создавали с помощью неодимового магнита размером 35 х 12 х 6 мм3 с аксиальным намагничиванием и покрытого никелем (ООО "Мир Магнитов", Россия).
Получение полиэлектролитных микрокапсул со встроенными уреазой и магнитными частицами. Составные микросферолиты CaCO'3—уреаза готовили по реакции ионного обмена, смешивая рас-
творы СаС12 и №2С03 в присутствии фермента [12]. Полиэлектролитные микрокапсулы получали из ПСС и ПАА путем поочередной адсорбции их на поверхность составных микросферолитов СаС03—уреаза в растворах полиэлектролитов с концентрацией 2 мг/мл, содержащих 0.5 М №С1 (рис. 1а). После нанесения трех полиэлектролитных слоев (ПСС/ПАА/ПСС) микрокапсулы инкубировали в течение 15 мин в 1%-ной суспензии Бе304. Затем микрокапсулы покрывали слоем ПСС и наносили еще 2 пары слоев ПАА/ПСС. После нанесения необходимого числа слоев (7) карбонатный компонент составного ядра растворяли в 0.2 М растворе ЭДТА в течение 12 ч. Полученные капсулы трижды отмывали дистиллированной водой для удаления продуктов распада составного ядра СаС03—белок. Все стадии получения микрокапсул с ферментом проводили при 20°С. Полученная суспензия содержала ~107 капсул в 1 мл (размером ~3—4 мкм) с ферментом (~3 пг уреазы в капсуле). Капсулы с ферментом хранили в дистиллированной воде при +4°С.
Преобразователь сигнала биосенсора. Использовали ПТ (НПО "Позитрон", Санкт-Петербург) с рН-чувствительной мембраной из Та205, толщиной 60—80 нм. Химическая чувствительность ПТ составляла 53—55 мВ/рН. Сигнал измеряли относительно А§/А§С1-электрода сравнения. После усиления сигнал поступал на компьютер для регистрации и обработки данных. ПТ располагали непосредственно на поверхности полюса магнита (рис. 1б). Микрокапсулы на затвор осаждали за счет постоянного магнитного поля, напряженность которого у полюсов магнита составляла 12000Э.
Н5
р
<
а, 4 д
к3
е
л
э
л се 2 н г и О 1
0 —I I 111111|—I I 111111|—I I 111111|—ГТТТПП]—ГТТТТПЦ—I I 111111|—I I 111111|—I I 111111|
100 101 102 103 104 105 106 107 108 Разбавление исходного раствора уреазы, раз
Рис. 2. Зависимость сигнала биосенсора на основе полиэлектролитных микрокапсул с встроенной уре-азой и магнитными частицами от степени разбавления исходного раствора, содержащего встроенную уреазу. Концентрация мочевины в кювете 0.1 М. Пунктирной линией показана величина сигнала рН-чувствительного транзистора на введение 0.1 М мочевины при отсутствии фермента.
Измерения выполняли при 20°С. В кювету ПТ объемом 30 мкл вносили 27 мкл суспензии микрокапсул. Магнитное поле приводило к фиксации их на поверхности затвора, после чего в кювету ПТ вносили 3 мкл раствора мочевины. Измеряемым параметром являлась амплитуда сигнала, которую оценивали по разнице исходного и конечного уровней сигнала ПТ до и после введения мочевины. Для очистки поверхности электрода после измерения биорецептор смывали дистиллированной водой, удалив магнит.
Модельные растворы мочевины готовили в 10 мМ растворе №С1 и в 10 мМ натрий—калий—фосфатном буферном растворе (рН 7.0, буферная емкость 0.0025).
В качестве реальных образцов для определения концентрации мочевины использовали молоко пастеризованное и ультрапастеризованное " Просто -квашино", жирность 3.2% (Юнимилк, Россия) и молоко ультрапастеризованное " Брест-Литовск", жирность 3.6% (ОАО "Савушкин продукт", Беларусь), разведенные дистиллированной водой до концентрации, необходимой для анализа.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Зависимость сигнала биосенсора от pH буферного раствора. Оптимальный интервал рН для функционирования уреазы — 6.8—7.2 [13]. Нами получены сигналы биосенсора в буферных растворах с рН от 5.3 до 8.7. Максимальную амплитуду ответа биосенсора наблюдали при рН 5.0—6.0. Наблюдае-
мый сдвиг оптимального диапазона в кислую область скорее всего связан с условиями, создаваемыми капсулированием фермента в полиэлектролиты с магнитными наночастицами. Так, ранее показано [14, 15], что связывание ферментов с на-ночастицами приводит к отклонению параметров реакции (рН, температуры) от оптимальных.
Зависимость сигнала биосенсора от степени разбавления исходного раствора полиэлектролитных капсул. Зависимость сигнала биосенсора от концентрации уреазы представлена на рис. 2. При разбавлении исходной суспензии в 106 раз сигнал биосенсора соответствует величине сигнала электрода, не содержащего биорецептор. Полученные данные дают информацию о том, при каких концентрациях можно регистрировать активность фермента. Так, для неразбавленной суспензии микрокапсул соотношение полезного сигнала к сигналу, вносимому раствором мочевины в отсутствие фермента, составляет 62.2; при разведении в 100 и 1000 раз это соотношение уменьшается до 30.5 и 19.8 соо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.