ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 3, с. 435-439
УДК 581.143:575.143:575.15:575.17
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА Stamina pistilloida У РАСТЕНИЙ ГОРОХА
© 2004 г. В. С. Зайцев, Э. Е. Хавкин
Институт сельскохозяйственной биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук, Москва
Поступила в редакцию 20.05.2003 г.
Методом прямой амплификации геномной ДНК двух сортов гороха (Pisum sativum L.) получены четыре новых гомолога гена Stamina pistilloida (Stp), ортолога генов UNUSUAL FLORAL ORGANS (UFO) и Fimbriata (Fim) Arabidopsis и львиного зева. Ген UFO/Fim участвует в детерминации клеток апикальной меристемы побега и флоральной меристемы и контролирует экспрессию генов класса B и C дифференциации органов цветка; кроме того, у растений гороха ген Stp контролирует форму листьев, высоту растений и число междоузлий до первого соцветия. Нуклеотидные и производные аминокислотные последовательности охарактеризованных нами гомологов Stp обнаруживают высокое сходство с геном-прототипом из сорта Torsdag (98%) и существенно различаются у сортов Filby и Sebeco 59-61-65-6, контрастных по форме сложного листа.
Pisum - Fimbriata - Stamina pistilloida - UNUSUAL FLORAL ORGANS - меристема побега - сложный лист - полиморфизм
Среди генов, контролирующих идентификацию стволовых клеток апикальной меристемы побега и их последующую детерминацию в апикальной меристеме побега и флоральной меристеме, довольно подробно изучен ген, получивший название UNUSUAL FLORAL ORGANS (UFO) у растений Arabidopsis и Fimbriata (Fim) у растений львиного зева [1-3]. В эмбриогенезе Arabidopsis ген UFO экспрессируется с начала стадии сердцевидного зародыша в клетках, которые затем образуют слои L2 и L3. Позже, на стадии торпедовидно-го зародыша, зона экспрессии UFO окружает кольцом стволовые клетки в центре апикальной меристемы, отграничивая их от зоны, за пределами которой затем активируются гены, необходимые для дифференциации органов побега [4]. Точно также локализована экспрессия UFO в меристеме соцветия, где этот ген участвует в регуляции ее размеров и числа зачатков цветков. При дальнейшей дифференциации меристемы соцветия экспрессия UFO сдвигается на периферию будущей флоральной меристемы, ограничивая клеточные деления в центральной зоне, и определяет зону экспрессии генов, контролирующих формирование лепестков и тычинок цветка [1-5].
Сокращения: Fim - Fimbriata; Pfo - Proliferating Floral Organs; Stp - Stamina pistilloida; UFO - UNUSUAL FLORAL ORGANS. Адрес для корреспонденции: Хавкин Эмиль Ефимович. 127550 Москва, Тимирязевская ул., 42. Институт сельскохозяйственной биотехнологии. Факс: 07 (095) 977-09-47; электронная почта: emil@iab.ac.ru
Ген гороха Stamina pistilloida (Stp) является ор-тологом гена UFO/Fim, но, по всей видимости, регулирует более широкой круг процессов в вегетативной и флоральной меристеме [6]. Подобно UFO/Fim у Arabidopsis и львиного зева, ген Stp гороха, а также ген Proliferating Floral Organs (Pfo), клонированный недавно из другого бобового растения, лядвенца (Lotus japonicus), контролируют формирование соцветия и участвуют в диффе-ренцировке лепестков и тычинок [6, 7]. Кроме того, рецессивные мутации по гену Stp приводят к замедлению формирования сложных листьев и уменьшению числа листочков в сложном листе, укорачиванию стебля и междоузлий (при общем увеличении числа последних) и удлинению периода до цветения (увеличению числа междоузлий до закладки первого соцветия) [6].
Генетический контроль развития растений гороха описан преимущественно на уровне фенотипов [8-14], отражающих сложное взаимодействие аллелей нескольких генов; лишь немногие из этих генов идентифицированы молекулярно-ге-нетическими методами [6, 12-14]. Гомологи Stp могут оказаться полезным инструментом для анализа полиморфизма по форме сложного листа и скорости развития растений. В данном сообщении описаны четыре новых гомолога гена Stp из двух сортов гороха, контрастных по форме сложного листа. Мы сравнили эти гомологи между собой и с уже известными генами Stp/Pfo/UFO/Fim, чтобы оценить полиморфизм Stp по первичному строению и связать этот полиморфизм с фенотипи-ческими различиями в строении сложного листа.
435
8*
МЕТОДИКА
Геномную ДНК выделяли описанным ранее методом [15] из зеленых листьев проростков гороха (Pisum sativum L.) сорта Filby и Sebeco 59-61-65-6 (номера по каталогу ВИР соответственно 7847 и 7795). Для ПЦР-амплификации использовали специфичные праймеры, указанные в работе Taylor и др. [6].
Мы использовали описанные ранее протоколы амплификации ДНК, разделения фрагментов ДНК, их выявления, клонирования и секвениро-вания и соответствующие реагенты, а также методы компьютерного анализа последовательностей [15].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Сравниваемые генотипы гороха резко различаются по строению сложных листьев (рис. 1): у сорта Filby редуцированы прилистники и все листики заменены усиками, напротив, лист сорта Sebeco 59-61-65-6 схож с таковым у растений дикого типа. Эти фенотипы соответствуют контрастным сочетаниям аллелей генов Unifoliata, Afila, Tendril-Less и Stipules reduced, определяющих строение сложного листа гороха [8, 9, 11, 12]. Можно предполагать, что ген Stp также впрямую или опосредованно участвует в формировании этих фенотипов.
Полученные нами гомологи (GenBank accession nos. AY274930-AY274933) на 98% сходны с геном-прототипом Stp из сорта Torsdag [6]. Между собой все четыре гомолога различаются незначительно; в одном из них (Stp-h1, AY274930) вслед-
ствие инсерции одного нуклеотида (С) в положении 1044 нарушена рамка считывания (рис. 2а). Taylor и др. [6] описали хорошо выраженные мутации stp-3 и stp-4 в строении цветков и листьев, связанные с заменами G на А в положении 1051 и 1111; эти мутации приводят к изменению фенотипа растений. Однако при сравнении нуклеотид-ных и производных аминокислотных последовательностей клонированных нами гомологов AY274930-AY274933 мы не наблюдали замен в тех участках Stp, где отмечены мутации у гена-прототипа (рис. 26). Два исследованных нами сорта гороха, контрастных по строению сложного листа (см. рис. 1), различаются по строению гена Stp сильнее, чем дикий тип и мутанты в работе Taylor и др. [6]. Что касается внутрисортовой изменчивости, то у двух гомологов, выделенных из сорта Sebeco 59-61-65-6 (AY274931 и AY274932), мы обнаружили только синонимические замены нуклеотидов. Более существенно различаются между собой два клона Stp (AY274930 и AY274933), выделенные из сорта Filby: по всей длине гена эти различия составляют семь нуклеотидов (полные нуклеотидные последовательности гомологов Stp не приведены, они доступны на сайте http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Производные аминокислотные последовательности пяти генов из трех сортов гороха (рис. 3) обнаруживают высокую степень сходства с генами-ортологами Pfo (71%), UFO (62%) и Fim (67%). Особый интерес представляет отрезок производной аминокислотной последовательности, показанный на рис. 3а: там, где выделенные нами гомологи Stp гороха отличаются от гена-прототипа, они сходны с геном-ортологом Pfo из лядвенца и
(a)
1 taccaagactgtcgtagtct
2 **********Q*_******* ß **********Q*^*******
(6)
stp-J a
1 atgttactgctgcaggtgatgacatgatatcaccttatgcagtcaaaaacctatcatctgaaagctttca
2 *************************************************************
^ **********************************************************************
stp-4 a
1 tatagatgcaagtgggttttactccatctggggaacaacctctteattaccaagactg
2 ********************************************************** 2 * * * Q* ********************** **************************** Q
Cj **********************************************************
Рис. 2. Фрагменты нуклеотидных последовательностей гомологов гена гороха Stamina pistilloida (Stp). а - сорта гороха: 1, 4 - Filby; 2, 3 - Sebeco 59-61-65-61. 1 - Stp-h1 (AY274930); 2 - Stp-h2 (AY274931); 3 - Stp-h3 (AY274932); 4 - Stp-h4 (AY274933). В скобках указаны номера GenBank accessions; б - сорта гороха: 1 - Torsdag, 2, 5 -Filby, 3, 4 - Sebeco 59-61-65-61. 1 - ген-прототип Stp (AF004843); 2 - Stp-h1 (AY274930); 3 - Stp-h2 (AY274931); 4 -Stp-h3 (AY274932); 5 - Stp-h4 (AY274933). Указаны замены нуклеотидов, вызванные в гене-прототипе мутациями stp-3 и stp-4.
(a)
27.8
(б)
гО
Ч
PsStp-h1 (AY274930) PsStp-h4 (AY274933) PsStp (AAD01204) PsStp-h2 (AY274931) PsStp-h3 (AY274932) Lj Pfo (AAN87351) AmFim (NP_564368) BrUFO (AA084017) AtUFO (NP_564368) IaFim (BAC67248)
25
20
15
10
5
0
Рис. 3. Фрагмент выравнивания (а) и дендрограмма полных производных аминокислотных последовательностей (б) генов Stamina pistilloida (Stp) гороха (соответственно, AAD01204, трансляция псевдогена AY274930 и AAP32285-AAP32287), Proliferating Floral Organs (Pfo) лядвенца (AAN87351), UNUSUAL FLORAL ORGANS (UFO) Arabidopsis (NP_564368) и гомолога UFO из Brassica rapa (AA084017), Fimbriata (Fim) львиного зева (A54840) и гомолога Fim из Impatiens arguta (BAC67248).
В скобках указаны номера GenBank accessions. По оси абсцисс - генетические расстояния Нея. а - 1-5 - Stp из Pisum sativum; 6 - Pfo из Lotus japonicus; 7 - Fim из Antirrhinum majus; 8 - UFO из Arabidopsis thaliana; б - обозначения видов растений: Ps - P. sativum; Lj - L. japonicus; Am - A. majus; Br - B. rapa; At - A. thaliana; la - I. arguta.
даже с генами UFO и Fim из систематически отдаленных видов растений - Arabidopsis и львиного зева. Таким образом, в последовательности Stp из гороха сорта Torsdag [6] этот участок существенно отклоняется от консенсуса, который сохраняется в генах Stp из сортов гороха Filby и Sebeco 59-
61-65-6. Сравнение пяти клонов Stp из трех форм гороха позволяет сделать вывод о незначительном внутривидовом полиморфизме этого гена. На дендрограмме (рис. 36) гены Stp выделяются в отдельный кластер, при этом отчетливо различаются ортологи из сортов гороха Filby и Sebeco 59-
61-65-6; ближе всего к этому кластеру располагается ген Pfo из лядвенца, растения того же семейства.
Формирование сложного листа томатов и гороха во многом сходно с формированием побега [6, 9, 11-13, 16]. В полностью сформированном сложном лис
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.