научная статья по теме ПОЛИМОРФИЗМ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ДИНУКЛЕОТИДНЫХ ЛОКУСОВ У ПАРТЕНОГЕНЕТИЧЕСКИХ ЯЩЕРИЦ DAREVSKIA UNISEXUALIS Математика

Текст научной статьи на тему «ПОЛИМОРФИЗМ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ДИНУКЛЕОТИДНЫХ ЛОКУСОВ У ПАРТЕНОГЕНЕТИЧЕСКИХ ЯЩЕРИЦ DAREVSKIA UNISEXUALIS»

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2009, том 424, № 1, с. 122-124

БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

УДК 577.11

ПОЛИМОРФИЗМ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ДИНУКЛЕОТИДНЫХ ЛОКУСОВ У ПАРТЕНОГЕНЕТИЧЕСКИХ ЯЩЕРИЦ БЛКЕУ8К1Л Ш18ЕХиЛЫ8

© 2009 г. А. В. Омельченко, В. И. Корчагин, Г. А. Севастьянова, О. Н. Токарская

Представлено академиком Ю.В. Ильиным 14.12.2007 г. Поступило 14.12.2007 г.

Вопросы геномной нестабильности и изменчивости микросателлитных локусов мало изучены у организмов с клональным типом наследования. В настоящей работе впервые проведено молеку-лярно-генетическое исследование индивидуальных локусов, содержащих (ОТ)„-микросателлиты у клонально размножающихся (партеногенетиче-ских) ящериц Багеу8к1а ишвехиаИз. Выявлен и детально охарактеризован полиморфный локус; показано, что аллели этого локуса различаются по размеру и структуре микросателлитного кластера.

Микросателлитные последовательности, относящиеся к тандемно организованным умеренным повторам ДНК эукариотических геномов, представляют значительный интерес как один из факторов нестабильности генома. Они варьируют по длине кластера и размеру повторяющегося звена, имеют высокие скорости мутирования от 10-2 до 10-5 в зависимости от типа микросателлита [1], что приводит к накоплению популяционно-специфических мутаций и позволяет использовать информацию об изменчивости микросателлитных локусов для анализа структуры популяций [2]. В настоящее время к наиболее изученным относятся микросателлиты человека, ряда животных и растений [3, 4]. В то же время однополые виды животных с клональным типом размножения остаются все еще малоизученными как с точки зрения структурной организации их генома, так и с точки зрения генетической изменчивости [5]. Среди всего спектра микросателлитных последовательностей особое значение имеют динуклео-тидные микросателлиты, которые не только наиболее широко представлены в геноме эукариот, но и являются наиболее эволюционно-консерватив-ными генетическими маркерами [6]. В связи с

Институт биологии гена Российской Академии наук, Москва Московский педагогический государственный университет

этим в данной работе проведено молекулярно-ге-нетическое исследование динуклеотидных микросателлитов на уникальной природной модели -облигатно-партеногенетическом виде кавказских скальных ящериц Darevskia unisexualis, который имеет гибридное происхождение от родоначаль-ных видов D. raddei и D. valentini [7].

В работе использована ранее полученная геномная библиотека D. unisexualis [8]. Методом гибридизации с колониями, при использовании оли-гонуклеотидных зондов, были отобраны и секве-нированы рекомбинантные клоны, содержащие микросателлиты (GT^-типов: Du231 (GenBank Ac. № EU252540), Du365 (Ac. № EU252543), Du255 (Ac. № EU252541), Du183 (Ac. № EU252539), Du214 (Ac. № EU252542), которые помимо динуклеотидных содержат также моно- и тринуклеотид-ные микросателлитные мотивы. Анализ полиморфизма этих локусов проводили с помощью локус-специфической ПЦР на популяционной выборке ДНК D. unisexualis.

Кровь самок D. unisexualis из 5 природных популяций Армении (N = 65) консервировали в 0.05 М ЭДТА рН 8.0 и хранили при 4°С. Образцы ДНК были выделены стандартным фенольно-хлоро-формным методом с использованием протеиназы К [9]. В качестве праймеров для монолокусного ПЦР были использованы олигонуклеотиды, указанные в табл. 1. Амплификацию проводили в 20 мкл реакционной смеси (50 нг ДНК) с использованием набора для ПЦР "GenePak® PCR Core" ("Isogene Lab.ltd", Россия) в четырехканальном ДНК-амплификато-ре "Терцик" ТП4-ПЦР-01 ("ДНК-технология", Россия) при следующих температурных режимах: денатурация при 94°С 3 мин, амплификация в течение 30 циклов (94°С 1 мин, отжиг праймеров 40 с, 72°С 40 с), элонгация 5 мин при 72°С. Определение нуклеотидной последовательности продуктов амплификации проводили методом Сэнгера с помощью набора реактивов ABI PRISM®BigDyeTM Terminator v.3.1. с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant. Последовательно-

ПОЛИМОРФИЗМ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ДИНУКЛЕОТИДНЫХ ЛОКУСОВ 123

Таблица 1. Условия ПЦР-амплификации пяти микросателлитных локусов партеновида D. unisexualis

Название локуса Пара праймеров Температура отжига, °С

Du231 (Ac. № EU252540) 5'-TCAAGAGGCCTCCCGAAAAG-3' (F) 5'-TGAGCCAGCTACCGTCATTCA-3' (R) 56

Du365 (Ac. № EU252543) 5'-GGGGCCCATTGTGTAAATACTGTA-3' (F) 5'-GGATTAAGGGGTTTTCTCAGGACA-3' (R) 55

Du255 (Ac. № EU252541) 5'-TCGCAGAGTGGCAGGAAACAAT-3' (F) 5'-TGCATCCAGCTCAACCAAAATACC-3' (R) 58

Du183 (Ac. № EU252539) 5'-ACAGACAAACACTCATAGAACACAT-3' (F) 5'-AATCAACAAGCCAAGAACAAAC-3' (R) 51

Du214 (Ac. № EU252542) 5'-TCACTTAAGGTTGACGCTGACTCA-3' (F) 5'-CTGAACAAGTTGTCCACCTCTGC-3' (R) 50

Таблица 2. Количественная оценка вариабельности локуса Du214 у партеновида D. unisexualis

Популяция Аллельный вариант Общее число особей

1 2 3 4 5 6

Кутчак 0 8 7 2 2 1 10

Лчап 0 10 10 0 0 0 10

Загалу 0 11 11 0 0 0 11

Нарадуз 0 17 17 0 0 0 17

Токярлу 12 17 5 0 0 0 17

По всем популяциям 12 63 50 2 2 1 65

Частота встречаемости 0.092 0.485 0.385 0.015 0.015 0.008

аллеля

сти выравнивали с использованием программы MegAlign 4.05.

С помощью ПЦР-амплификации нами было проанализировано пять динуклеотидных локусов на выборке из пяти популяций D. unisexualis. Оказалось, что лишь один из них (Du214, Ас. № EU252542) был полиморфен, а остальные - мономорфны. На рис. 1 представлены картины электрофорети-ческого фракционирования ПЦР-продуктов, полученных при амплификации образцов ДНК из разных популяций D. unisexualis. Видно, что особи D. unisexualis являются гетерозиготами по локусу Du214, а также, что исследуемый локус у данного партеновида представлен шестью различающимися по электрофоретической подвижности вариантами. Данные по частоте встречаемости представлены в табл. 2. В частности, аллели 2 и 3 были в одинаковом соотношении представлены в популяциях Лчап, Загалу и Нарадуз. Популяция Такярлу содержала три аллеля - варианты 1, 2, 3. Популяция Кутчак оказалась наиболее вариабельной - ее особи являлись носителями пяти аллель-ных вариантов. ПЦР-продукты каждого аллельно-го варианта были далее клонированы и секвениро-

ваны. На рис. 2 представлены нуклеотидные последовательности аллельных вариантов локуса Du214. Все аллели локуса Du214 различаются по длине микросателлитного кластера за счет различий в числе (GT^-повторов. Интервал различий составляет от 21 до 29 мономеров. Кроме того, как видно из данных рис. 2, аллели Du214 различаются также и точковыми мутациями в начале

M

250 пн. ^ 13 56

2 4

200 п.н.

Рис. 1. Электрофорез в 8%-ном нативном ПААГ ПЦР-продуктов, соответствующих аллельным вариантам локуса Du214 D. unisexualis. В качестве маркера молекулярной массы использовали 50 bp Ladder ("Fermentas", Литва) с шагом 50 п.н. Цифрами указаны аллельные варианты.

124

ОМЕЛЬЧЕНКО и др.

аллель1 аллель2 аллель3 аллель4 аллель5 аллель6

A A GA A GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT------

AAGAAGTAflGT GTGT GTGT GTGT GTGT GTGT GTGT GTGT GTGT GTGTGT--------------

AAGAA Gï GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GTGT GT CT GT GT GT CT CT GT GT CT CT GT GT.....

A A GA A GT A A GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT------------

A A GA Ä GT CT GT GT GT CT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT Gl AAGAA GTGT CT GTGTGT GT GTGTGT GT GTGTGT GT GT GTGT GT GTGT GTGT GT........

AAAGCCACTT AAAGCCACTT AAAGCCACTT AAAGCCACTT AAAGCCACTT AAAGCCACTT

Рис. 2. Нуклеотидные последовательности микросателлитных кластеров аллелей локуса Du214 партеногенетическо-го вида D. unisexualis. (ОТ)„-кластеры выделены прямоугольной рамкой. Нуклеотидные вариации показаны серым прямоугольником.

микросателлитного кластера. Сочетания таких фиксированных точковых мутаций образуют гап-лотипы G-T (аллели 1, 3, 5, 6) и A-A (аллели 2, 4), которые являются специфическими маркерами для каждого аллеля, предположительно наследуемыми от разных двуполых родительских видов. Очевидно, для доказательства этого предположения необходимо выявить эти аллели и гаплотипы у родительских видов D. raddei и D. valentini.

При сравнительном анализе пяти (GT^-содер-жащих локусов обнаружено соответствие между строением локуса и уровнем его полиморфизма. Микросателлитные локусы, имеющие сложное строение - содержащие различные типы микросателлитов или несовершенные мономерные звенья в кластере (Du231, Du365, Du255 и Du183), являются мономорфными, в то время как локусы, имеющие протяженные совершенные микроса-теллитные кластеры (Du214), демонстрируют достаточно высокий уровень полиморфизма.

Таким образом, в работе впервые клонированы и секвенированы 5 локусов, содержащих (GT)n-микросателлиты, один из которых оказался полиморфным. Установлена молекулярная структура аллелей этого локуса; показано, что их различия связаны с вариациями размера микросателлитных кластеров и точковыми мутациями в самой микросателлитной ДНК. Ранее сходные аллель-ные вариации были показаны на тетрануклеотид-ных микросателлитных локусах Du215, Du323, Du281 [10] у D. unisexualis и в популяциях других партеногенетических видов - D. armeniaca для локуса Du215 [11] и D. dahli для локуса Du323 [12]. Однако в этих случаях авторы обнаруживали точ-ковые мутации, образующие гаплотипы в прилежащих к микросателлитному кластеру областях. В отличие от тетрануклеотидных локусов D. unisexualis Du214 содержит точковые мутации непосредственно в самом микросателлитном кластере. Полученные нами данные демонстрируют, что микросателлитная изменчивость является од-

ним из факторов клонального и генетического разнообразия партеновидов.

Авторы выражают благодарность члену-корреспонденту РАН А.П. Рыскову за критические замечания и ценные советы по статье.

Работа частично финансировалась грантом РФФИ 08-04-00668, грантом Президента РФ МК-4748.2007.4 и подпрограммой Президиума РАН "Динамика генофондов".

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ellegren H. // Genetics, 2004. V. 5. P. 435-445.

2. Rosenberg N.A., Pritchard J.K, Weber J.L. et al. // Science. 2002. V. 298.

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком