ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 9, с. 1087-1090
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 575.17:595.341.1
ПОЛИМОРФИЗМ мтДНК ЭПИШУРЫ ОЗЕРА БАЙКАЛ - КЛЮЧЕВОГО ЭНДЕМИЧНОГО ВИДА ПЛАНКТОННОГО СООБЩЕСТВА
© 2015 г. И. Ю. Зайдыков, Т. Ю. Майор, Л. В. Суханова, С. В. Кирильчик, Е. Ю. Наумова
Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук, Иркутск 664033
e-mail:@ igorrock11@gmail.com Поступила в редакцию 04.10.2014 г.
Изучена популяционная структура Epischura baicalensis Sars (Copepoda, Calanoida), одного из ключевых эндемичных видов планктонного сообщества озера Байкал. Анализ полиморфизма митохон-дриальной ДНК не выявил генетической подразделенности между образцами эпишуры из разных бассейнов озера или между летней и зимней генерациями. Байкальская эпишура представлена единой панмиксной популяцией с высоким уровнем гаплотипического разнообразия мтДНК.
DOI: 10.7868/S0016675815080135
Байкальская эпишура (Е. Ъшеактю 8аге, 1900) — третичный реликтовый эндемичный вид, встречающийся во всей толще воды, в пелагиали Байкала, в течение всего года [1—3]. Это один из главных элементов в рационе рыб и водных беспозвоночных — важное звено в круговороте биологического вещества и энергии в озере. Биология и экология байкальской эпишуры хорошо изучены, но до сих пор нет единого мнения о популяционной структуре вида.
Можно предположить, что пассивный перенос копепод в озере ограничен, по крайней мере до определенной степени, так как озеро имеет большую глубину, значительную протяженность (673 км) и разделено на три бассейна высокими поднятиями дна, что может быть причиной популяционной подразделенности Е. Ъа1са1ет15. Вместе с тем существует мнение, что популяции эпишуры смешиваются полностью движением водных масс, обусловленным ветрами и течениями различных типов [2]. По той же причине подвергается критике гипотеза о том, что глубоководная эпишура представлена отдельной популяцией [3, 4].
В течение года на фоне постоянного присутствия всех возрастных групп эпишуры в пелагиа-ли [5, 6] прослеживается два пика размножения [1, 2]. Зимне-весеннее и летнее поколения отличаются по продолжительности метаморфоза и продолжительности жизни взрослых особей. На-уплии и взрослые особи из зимне-весеннего поколения крупнее, чем особи из летнего поколения. Общая продолжительность жизни особей из каждого поколения составляет год. Некоторые исследователи считают (личное сообщение), что наличие двух поколений может быть дополнительным основанием для внутривидовой подраз-деленности. В то же время утверждается, что взрослые особи зимне-весеннего поколения яв-
ляются "материнским стадом" для летнего поколения и наоборот [2]. В представленной работе нами проанализирован генетический полиморфизм у особей байкальской эпишуры, отобранных в разных котловинах озера, и в зимний, и весенний сезоны. В качестве эволюционного маркера использован фрагмент гена первой субъединицы цитохромоксидазы (COI) митохондриальной ДНК. Маркер COI уже использовался для попу-ляционно-генетических исследований байкальских водных беспозвоночных, главным образом бентосных форм [7, 8], продемонстрировав свою эффективность в выявлении популяционной подразделенности. Исследования популяцион-ной структуры пелагических форм байкальских беспозвоночных с использованием данного маркера ранее не проводились.
Байкальскую эпишуру отбирали в трех котловинах озера: южной (p = 25 экз.), центральной (p = 20) и северной (p = 15), в летний (p = 21) и зимний (p = 20) периоды размножения.
Суммарную ДНК выделяли из яйцевых мешков эпишуры. Фиксированные в этаноле рачки выдерживали в дистиллированной воде 10—15 мин для удаления остатков спирта, после чего происходило отделение яйцевых мешков. ДНК выделяли в 10 мкл следующей смеси: 1—2 яйцевых мешка от одной самки эпишуры и 1 мкг протеиназы К в 2х буфере для ПЦР, содержащем 32 мМ (NH4)2SO4, 130 мМ Трис-HCl, рН 8.8 (25°С), 0.2% твин 20, инкубировали при температуре 65°С в течение 1 ч и нагревали при 94°С в течение 5 мин для инактивации протеиназы К. Полученную смесь хранили при —20°С. Для амплификации фрагмента гена COI использовали универсальные праймеры LC01490 (5' - GGTCAACAAATCATAAAGATAT-TGG-3') и HC02198 (5'-TAAACTTCAGGGT-GACCAAAAAATCA-3') [9]. Условия для ПЦР в
1088
ЗАЙДЫКОВ и др.
а
б
Медианные сети гаплотипов, построенные в программе NETWORK 4.5 на основе нуклеотидных последовательностей фрагмента гена COI мтДНК байкальской эпишуры. а — сеть гаплотипов из разных котловин озера, б — из разных сезонов размножения. Размеры кругов пропорциональны количеству особей, обладающих соответствующим гаплотипом. Длина ветвей пропорциональна количеству мутационных шагов.
реакционном объеме 10 мкл были следующими: 0.1 мкл выделенной смеси, 0.5 мкМ каждого праймера, 1.5 мМ MgCl2 и по 0.2 мМ каждого дНТФ, 0.5 ед. акт. Dream- Taq-полимеразы (Fermentas). ПЦР проводили по схеме: начальная денатурация 2 мин при 94°С (1 цикл), 40 циклов амплификации — 15 с при 94°С, 20 с при 48°С, 60 с при 72°С и достройка цепи 4 мин при 72°С. В
дальнейшем были подобраны специальные внутренние пары праймеров (ЬС01 Ер18сИига 5'-ТТО-ОЛАСТСТТТЛТТТЛСТТОСТО-З' и НС01 Ерь 8сИига - 5'- СААААТАААТОТТООТАТААААТ-АО-3'). Стабильный продукт амплификации, 566 пн, был получен при температуре отжига 58°С. Ампликоны были разделены с помощью электрофореза в 0.6%-ном агарозном геле, содер-
ПОЛИМОРФИЗМ мтДНК ЭПИШУРЫ ОЗЕРА БАЙКАЛ
1G89
жащем 1x Трис-ацетатный буфер без добавления ЭДТА (G.G4 М Трис-ацетат, рН 7.6). Участки, содержащие ампликоны, вырезали из геля, замораживали при —20°С, оттаивали и центрифугировали в течение 1G мин при 12GGG об/мин. Полученный элюат использовали в реакции секвенирования. Обе цепи секвенировали на автоматическом се-квенаторе ABI Prism 31GG Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA) c Big Dye terminator sequencing kit (Applied Biosystems, USA) в Центре секвенирования ДНК Сибирского отделения Российской академии наук (Новосибирск, Россия, http://sequest.niboch.nsc.ru).
Выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили с использованием программного обеспечения ClustalW, реализованного в программе MEGA 5.G [1Gj. Предварительный анализ нуклеотидных последовательностей и оценка уровней гаплотипического (Hd) и нуклеотидного (р) разнообразия проводились в программе DnaSP 4.1G.3 [11]. Генеалогию гаплотипов оценивали в программе NETWORK 4.5 (http://fluxus-engineering.com/) с использованием алгоритма "Median joining" [12]. Анализ молекулярной вариации (AMOVA) проводили в программе ARLEQUIN 3.11 [13], образцы группировали в зависимости от места отбора или сезона отбора проб.
Фрагмент нуклеотидной последовательности гена COI размером 566 пн определен для 6G образцов эпишуры. Данные помещены в GenBank под номерами доступа KC68383G-KC683889. Анализ последовательностей выявил 65 вариабельных позиций, среди которых 5 находились в первом положении кодона. В общей сложности 32 позиции были филогенетически информативными. Трансверсии обнаружены в 9 позициях. Все замены являлись синонимичными.
Почти все анализируемые гаплотипы (52 из 6G) были представлены в единственном числе. Четыре гаплотипа обнаружены 2 раза. Гаплотипиче-ское (Hd) и нуклеотидное (р) разнообразие эпишуры составило G.998 и G.GG9 соответственно. Высокий уровень разнообразия гаплотипов, по-видимому, свидетельствует о большом эффективном размере популяции и низком генетическом дрейфе.
С помощью анализа молекулярной вариации (AMOVA) обнаружен высокий уровень внутри-групповой изменчивости — 99.63% (для особей из разных котловин) и 99.88% (для особей из разных генераций), а также низкий уровень изменчивости между сравниваемыми группами — G.37% (для групп особей из разных котловин) и G.12% (для групп особей из разных генераций), что демонстрирует отсутствие популяционной подразде-ленности E. baicalensis внутри озера. Соответственно значение индекса FST составило G.GG37 (для групп особей из разных котловин) и G.GG12
(для групп особей из разных генераций). Эти оценки свидетельствуют о высоком уровне обмена генами между сравниваемыми группами. Сравнения популяций эпишуры из трех бассейнов озера и в разные сезоны, проводимые с использованием NETWORK 4.5, также не выявили популяционной подразделенности — гаплотипы не образовывали каких-либо четких кластеров. Наличие нескольких вариантов медианных сетей в обоих сравнениях не повлияло на интепрета-цию результатов, поскольку варианты имели равное минимальное количество мутационных шагов и незначительно отличались расположением некоторых ветвей (рисунок).
Таким образом, анализ полиморфизма мито-хондриального гена COI не выявил какой-либо генетической подразделенности между выборками из разных котловин озера или из летней и ве-сенне-зимней генераций. Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что байкальская эпишура представлена единой панмиксной популяцией, по-видимому, с большой эффективной численностью, что характерно для большинства пелагических видов.
Работа частично поддержана интеграционным проектом СО РАН № 51 "Динамичность молекулярной организации хроматина в специфических доменах геномов эукариот" и проектом № VI.50.1.4 "Молекулярная экология и эволюция живых систем Центральной Азии на примере рыб, губок и ассоциированной с ними микрофлоры" (№ 03452014-0002).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Кожов М.М. Биология озера Байкал. М.: Изд-во АН СССР, 1962. 312 с.
2. Афанасьева Е.Л. Биология байкальской эпишуры. Новосибирск: Наука, 1977. 144 с.
3. Afanayeva E.L. Life cycle of Epischura baicalensis Sars (Copepoda, Calanoida) in Lake Baikal // J. Marine systems. Special Volume Proceedings of the 6th International Conference on Copepoda. 1998. V. 15. P. 351 — 357.
4. Боруцкий Е.В., Степанова Л.А., Кос М.С. Определитель Calanoida пресных вод. CCCR Л.: Наука, 1991. 504 с.
5. Ясницкий В.Н. Материалы к познанию планктона озера Байкал // Тр. Иркут. о-ва естествоиспытелей. 1923. Т. 1. Вып. 1. С. 31-74.
6. Яшнов В.А. Планктон озера Байкал по материалам Байкальской экспедиции Зоол. музея МГУ в 1917 г.// Русск. гидробиол. журн. 1922. Т. 1. № 8. С. 225-238.
7.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.