научная статья по теме ПОЛИПЕПТИДНЫЙ ТОКСИН ИЗ МОРСКОЙ АНЕМОНЫ, ИНГИБИРУЮЩИЙ ПРОТОНЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ КАНАЛ ASIC3 Химия

Текст научной статьи на тему «ПОЛИПЕПТИДНЫЙ ТОКСИН ИЗ МОРСКОЙ АНЕМОНЫ, ИНГИБИРУЮЩИЙ ПРОТОНЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ КАНАЛ ASIC3»

Ш

БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2012, том 38, № 6, с. 653-659

УДК 577.112.083

ПОЛИПЕПТИДНЫЙ ТОКСИН ИЗ МОРСКОЙ АНЕМОНЫ, ИНГИБИРУЮЩИЙ ПРОТОНЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ КАНАЛ ASIC3

© 2012 г. С. А. Козлов*, #, Д. И. Осмаков*, Я. А. Андреев*, С. Г. Кошелев*, И. Н. Гладких**, М. М. Монастырная**, Э. П. Козловская**, Е. В. Гришин*

*Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

**Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения Российской академии наук им. Г.Б. Елякова, 690022, Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159 Поступила в редакцию 07.02.2012 г. Принята к печати 11.03.2012 г.

Из экстракта цельных морских анемон Heteractis crispa методом многостадийной жидкостной хроматографии был получен полипептидный токсин п-AnmTX Hcr 1b-1 с молекулярной массой 4537 Да. По результату поиска гомологии по алгоритму BLAST новый токсин относится к группе гомологов известных токсинов анемон BDS и APETx, при этом сходство аминокислотной последовательности не превышало 50%. В электрофизиологических экспериментах на экспрессированных в ооцитах Xenopus laevis ASIC3-рецепторах токсин подавлял амплитуду быстрой составляющей интегрального тока. Расчетное значение IC50 составило 5.5 ± 1.0 мкМ. Среди известных полипептидных блокаторов ASICs-каналов токсин п-AnmTX Hcr 1b-1 оказался наименее активным ингибитором, что, по нашему мнению, связано с низким содержанием заряженных аминокислотных остатков в его структуре.

Ключевые слова: морские анемоны; полипептидные токсины; протончувствительные каналы; А$1С3- рецепторы, электрофизиологические исследования.

ВВЕДЕНИЕ

Среди разнообразных морских организмов, способных продуцировать яд для охоты и защиты, особое место занимают морские анемоны. Отличительная особенность ядов этих малоподвижных пассивных хищников — наличие в них большого числа биологически активных молекул, которые обладают направленным действием на различные биологические мишени и при этом характеризуются огромным структурным разнообразием. Так, помимо большого числа полипептидных токсинов - блокаторов ионных каналов, преимущественно натриевых и калиевых [1-6], были выделены разнообразные цитотоксические компоненты [7-10] и ингибиторы протеолитиче-ских ферментов [11-13].

Сокращения: ASIC — протончувствительный ионный канал, BLAST — basic local alignment search tool, BSA — бычий сывороточный альбумин, HERG — human ether-a-go-go-related gene, HEPES — 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтан-сульфокислота, MALDI — матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация, MES — 2-(4-морфолино) этансульфокислота, TRPV1 — ваниллоидный рецептор 1, TFA — трифторуксусная кислота, EDTA — этилендиамин-тетрауксусная кислота # Автор для связи (тел.: (495) 336-65-40; факс: (495) 330-73-01; эл. почта: serg@ibch.ru).

Размер биологически активных полипептидных молекул колеблется в интервале от 20 до более 200 а.о. В последнее время изучение компонентов ядов, продуцируемых морскими анемонами, активно проводится во многих лабораториях, при этом обнаруживаются все новые и новые интересные с функциональной точки зрения молекулы.

Сегодня наибольший практический интерес имеют биологически активные молекулы с узкой специфичностью к определенным мишеням [14]. На настоящий момент, морские анемоны мало изучены, но они являются очень перспективным источником таких молекул. В них были обнаружены: селективные ингибиторы калиевых каналов Ку31 и Ку32, названные BDS-пептидами [15]; токсин В§К - ингибитор калиевых каналов Shak-ег-типа Ку1Л, Ку12 и Ку13 [16]; два токсина В§П и В§Ш, замедляющие инактивацию тетродоток-синчувствительных натриевых каналов [17]. Из тихоокеанского вида АпЛоркыга были

выделены два интересных полипептидных токсина: АРЕТх1, специфично ингибирующий человеческие ИЕЯО-каналы [18], и АРЕТх2, ингибирующий протончувствительные каналы ASIC3-типа [19]. Известны также анальгетические полипептиды АРИС1-3, которые селективно модулируют

активность ваниллоидного рецептора TRPV1 [20-22].

В данной работе представлены результаты поиска специфических ингибиторов протончув-ствительных каналов ASIC3. Выбор этого рецептора в качестве объекта исследования связан с его вовлеченностью в процесс восприятия хронической боли, вызванной закислением внеклеточной среды, и принадлежностью к классу основных рецепторов сенсорных нейронов [23, 24]. Источником для поиска новых полипептидов послужил этанольный экстракт из морской анемоны Heter-actis crispa, из которого ранее были выделены специфичные полипептидные токсины с другой биологической функцией [20, 22, 25].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Поиск активных компонентов в экстракте морской анемоны H. crispa проводили по хорошо зарекомендовавшей себя схеме, совмещающей последовательное многостадийное фракционирование с постоянным измерением биологической активности в электрофизиологических экспериментах. Начиная с исходного природного экстракта, в электрофизиологических экспериментах на ооцитах лягушки одна из получаемых при разделении фракций устойчиво показывала достоверное ингибирование регистрируемых токов, вызываемых резким закислением среды. Измеренный эффект колебался в пределах 25-70% уменьшения амплитуды измеряемого интегрального тока, однако для экономии труднодоступного биологического материала зависимость эффекта от количества белка в анализируемых фракциях не проводили. Всего было проведено

шесть последовательных стадий хроматографиче-ского разделения, для которых использовали гидрофобные, ионообменные, гель-фильтрационные и обращенно-фазовые сорбенты (рис. 1). Использование столь сложной схемы для разделения компонентов связано с наличием большого количества полипептидов со сходными аминокислотными последовательностями, что характерно для многих ядовитых животных, синтезирующих обширные природные комбинаторные библиотеки токсинов [26, 27].

В итоге из спиртового экстракта H. crispa был получен в чистом виде единственный полипептид, получивший название я-AnmTX Hcr 1b-1 в соответствии с новой, улучшенной номенклатурой для полипептидов морских анемон [28]. Средняя измеренная молекулярная масса выделенного полипептида равнялась 4537 Да. Алкили-рованный по аминокислотным остаткам цистеи-на продукт отличался от природного полипептида ровно на 6 добавленных групп этилпиридина.

Полная аминокислотная последовательность нового полипептидного токсина была установлена методом последовательной деградации белка без привлечения методов генной инженерии. Последовательность 39 ^-концевых аминокислотных остатков была прочитана деградацией полипептидной цепи по методу Эдмана. Последовательность оставшихся двух С-концевых аминокислот была определена с помощью MALDI-масс-спек-трометрического анализа полипептида, частично фрагментированного экзопротеиназой CPY. Таким образом, окончательная аминокислотная последовательность токсина я-AnmTX Hcr 1b-1 выглядит как:

GTPCKCHGYIGVYWFMLAGCPNGYGYNLSCPYFLGICCVDR

Расчетная масса отличается от измеренной на 0.3 Да, поэтому можно утверждать, что природный токсин не имеет в своем составе модифицированных аминокислотных остатков.

Проведенное сравнение аминокислотной последовательности нового полипептида с известными данными по алгоритму BLAST [29] выявило семь умеренно гомологичных последовательностей (рис. 2). Все обнаруженные последовательности принадлежали к токсинам из морских анемон. Среди них: три токсина Bcg III XX.XX, которые были обнаружены в ходе протеомных исследований морской анемоны Bunodosoma cangicum, и для них пока неизвестны ни биологическая мишень, ни последовательность нескольких С-концевых аминокислот [30]. Кроме того, последовательность я-AnmTX Hcr 1b-1 гомологична частичной последовательности полипептида BcV и полно-

размерной последовательности паралитического пептида Бе1У с также неустановленной биологической активностью. Оба они были найдены в яде морской анемоны Bunodosoma caissarum [31]. И, наконец, выявлена гомология с двумя детально охарактеризованными токсинами из морской анемоны Л. elegantissima АРЕТх1 и АРЕТх2, для которых известна их способность специфично ингибировать каналы НЕИ^ и А81С3 соответственно [18, 19].

У всех перечисленных выше токсинов просматриваются общие структурные мотивы, несмотря на умеренную гомологию первичной структуры. В соответствии с мотивами распределения остатков цистеина [28] — это полипептиды из структурной группы 1Ь. К этой группе относятся также токсины-блокаторы К+-каналов, именуемые BDS, из яда морской анемоны Лпетота у^-

A280 1.0

(а)

A

280

A

280

EtOH, % 40

- 30

46 Объем, л (б)

1.0

Объем, л (в)

A280 0.4

(г)

[AcON4], M

0.2

20 0.2 10 0.1

0

[NaCl], M A210 0.50 1.00

0.3 0.6

Объем, л

(д) CH3CN, %

60

- 40

0.25

- 20

0

A210 1.00

20 40

Время, мин

(e) CH3CN, %

-, 60

- 40

60 80 Объем, л

20

6 12 Время, мин

Рис. 1.Этапы хроматографического выделения токсина я-AnmTX Hcr lb-1 из тотального экстракта морской анемоны

H. crispa. (а) Профиль элюции компонентов с колонки Полихром-1 (ХромЛаб, Россия) 4.8 x 95 см, со скоростью 120 мл/ч в ступенчатом градиенте концентрации этилового спирта; (б) профиль элюции компонентов с колонки Cellulose CM-32 (Whatman) 2.5 x 60 см, уравновешенной в 0.05 M аммоний-ацетатном буфере (pH 4.5), при скорости потока 20 мл/ч и линейном градиенте концентрации NaCl; (в) профиль элюции компонентов с колонки Biogel P-6 (Bio-Rad)

I.4 x 60 см, уравновешенной в 0.1 M аммоний-ацетатном буфере (pH 8.6), при скорости потока 8 мл/ч; (г) профиль элюции компонентов с колонки BioRex 70 (Bio-Rad) 1.9 x 27 см, уравновешенной в 0.01 M аммоний-ацетатном буфере (pH 6.0), при скорости потока 15 мл/ч и градиенте концентрации ацетата аммония (0.01—0.2 M); (д) результаты ВЭЖХ на колонке Jupiter C5 (Phenomenex) 10 x 250 мм в присутствии 0.1% TFA, скорости элюции 4 мл/мин и линейном градиенте концентрации ацетонитрила; (е) результаты ВЭЖХ на колонке Vydac C18 (Grace) 4.6 x 250 мм в присут

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком