БИОХИМИЯ, 2011, том 76, вып. 4, с. 520 - 524
УДК 577.29
ПОЛОЖИТЕЛЬНОЕ ВЛИЯНИЕ ГЛУТАТИОНА НА ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТЬ ПРОБИОТИЧЕСКОГО МИКРООРГАНИЗМА - БАКТЕРИИ Lactobacillus reuteri*
© 2011 г. КиБейом Ли1, Хо-Джин Ким1, Бейом-Сейоп Ро1, Санг-Ки Канг2, Юн-Джаи Чои2**
1 Department of Biotechnology, Songdo Technopark, 6FMichuhol Tower, 7-50 SongdoDong, Yeonsu-Gu, Incheon 406-840, Republic of Korea; E-mail: klee02@empal.com
2 Laboratory of Animal Cell Biotechnology, Department of Agricultural Biotechnology, Seoul National University, Building200-#4204, Sillim-9dong, Seoul 151-742, Republic of Korea; E-mail: cyjow@snu.ac.kr
Поступила в редакцию 30.10.10 После доработки 19.11.10
Глутатион (GSH) — широко распространенный природный небелковый тиоловый реагент, принимающий участие во многочисленных клеточных процессах. Ранее мы показали, что глутатион опосредует устойчивость бактерий Lactobacillus salivarius в кислой среде. В настоящей работе изучено участие глутатиона в процессе роста бактерий Lactobacillus reuteri и представлены данные, свидетельствующие о том, что GSH является необходимым функциональным компонентом бактериальных клеток. Добавление в культуральную среду 0,5 мМ GSH в качестве единственного источника серы стимулировало клеточный рост, поглощение глюкозы и потребление аминокислот, приводило к увеличению уровня клеточного глутатиона и сопровождалось повышением содержания клеточного белка. Полученные данные свидетельствовали о том, что глутатион является питательным веществом для бактериальных клеток.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: глутатион, Lactobacillus reuteri, содержание белка, потребление аминокислот, рост бактериальной культуры.
Lactobacillus являются грамположительными лактобактериями (ЛБ), обитающими в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) животных и человека [1]. Эти бактерии привлекают большое внимание исследователей в связи с их эффективным оздоровительным действием на организм. Они выступают в качестве пробиотиков, когда попадают в ЖКТ в достаточных количествах. Интерес фундаментальной и отраслевой науки прикован к изучению положительного эффекта пробиотиков, использующихся в качестве оздоровительных добавок к пище животных и человека.
ЛБ способствуют процессам ферментации, протекающим в желудочно-кишечном тракте, и тем самым противостоят различным видам стресса, вызываемого пищевыми продуктами, неблагоприятным воздействием окружающей
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 10-329, 30.01.2011.
** Адресат для корреспонденции.
среды и окислительным стрессом. Лактобакте-рии довольно чувствительны к пищевым компонентам и требуют тщательного подбора условий выращивания в культуре [2]. Эти условия обычно соблюдаются в организме хозяина (животное, человек) in vivo, а также в присутствии комплекса субстратов (пептон, дрожжевой экстракт, мясной и казеиновый гидролизаты) при выращивании in vitro [3]. Аминокислоты стимулируют рост ЛБ и продукцию лактата [4—5]. В представленной работе мы изучали влияние GSH на рост бактерий L. reuteri в среде Де-Мен-Рогоза-Шарпа (MRS).
Глутатион присутствует во многих организмах и является широко распространенным внутриклеточным небелковым тиоловым реагентом. Предполагается, что он принимает участие во многих клеточных процессах: транспорте аминокислот, синтезе белков и нуклеиновых кислот, модуляции активности ферментов, метаболизме ксенобиотиков, обезвреживании канцерогенов, элиминации реактивных форм кислорода [6—10]. Однако влияние GSH на рост грам-
а
Время, ч
Аналитические методы. Плотность клеточной суспензии определяли по поглощению при 600 нм. Содержание глюкозы определяли энзиматичес-ки с использованием набора фирмы «Sigma» (США). Внутриклеточную концентрацию глута-тиона определяли как было описано ранее [12]. В разные интервалы времени клетки собирали центрифугированием при 10 000 g в течение 15 мин при 4° и промывали 100 мМ Tris-HCl-буфером, pH 7,5, замораживали при —80°, а затем ресус-пендировали в 500 мкл 62,5 мМ Tris-HCl-бу-фера, pH 6,8 и лизировали с помощью стеклянных шариков диаметром 150—212 мкм («Sigma») с помощью системы для гомогенизации FastPrep-24 («MP Biomedicals»). Клеточный ли-зат осветляли центрифугированием при 10 000 g в течение 10 мин при 4°, затем переносили в пробирки объемом 1,5 мл «Eppendorf» и хранили при —80° или 4°. Концентрацию белка измеряли с помощью набора фирмы «Pierce» и БСА в качестве стандарта. Содержание свободных аминокислот в культуральной среде определяли после гидролиза пептидных компонентов среды
Рис. 1. Временная зависимость плотности культуры клеток бактерий Ь. гвШвп (а) и концентрации глюкозы в культуральной среде (б) в отсутствие или в присутствии 0,5 мМ в8Н. (Здесь и далее на рисунках каждое значение на графике является средним арифметическим, полученном из трех независимых экспериментов)
положительных бактерий рода Lactobacillus изучено недостаточно. Ранее мы сообщали о значении глутатиона в реакции бактерий L. salivarius на закисление среды [11] и сделали предположение о том, что глутатион может играть большую роль в метаболизме грамположительных ЛБ. Поэтому мы добавляли GSH в среду выращивания бактерий L. reuteri и показали, что бактериальные клетки способны утилизировать этот реагент в качестве источника серы, и, следовательно, имеет смысл вносить его в культураль-ную среду выращивания ЛБ.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Линии бактерий и ростовая среда. Бактерии L. reuteri ATCC23272 культивировали в среде MRS «Difco Laboratories» при pH 6,5 и 37° в течение ночи на шейкере при 150 об/мин. Аликвоты объемом 2 мл отбирали и переносили в 200 мл свежей среды, не содержащей (контроль) или содержащей 0,5 мМ GSH и культивировали в тех же условиях в течение 10 ч.
б
Время, ч
Рис. 2. Временная зависимость концентрации растворимого клеточного белка (а) и содержания внутриклеточного (б) в бактериях Ь. гвШвп, выращенных в отсутствии или в присутствии 0,5 мМ глутатиона
522
КИБЕЙОМ ЛИ и др.
в 6 М HCl в течение 24 ч при 110° под вакуумом с помощью автоматического анализатора Model L-8800A «Hitachi» (Япония).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для ответа на вопрос, является ли глутатион источником питательных веществ для бактерий L. reuteri, клетки культивировали в отсутствие и в присутствии 0,5 мМ GSH. Как видно на рис. 1, а и б, присутствие восстановленного глутатиона в культуральной среде стимулировало пролиферацию бактериальных клеток и потребление ими глюкозы. Стимуляция роста культуры могла быть обусловлена тем, что трипептид глутати-
он транспортируется в клетки бактерий Ь. геШеп и может служить в качестве эндогенного источника аминокислот. С другой стороны, известно, что С8И защищает клетки бактерий Ь. за1папиз от кислотного стресса [11]. Возможно, что стимулирующий эффект глутатиона на клеточный рост Ь. геШеп осуществляется посредством этих двух различных механизмов. Кроме того, поскольку глюкоза является для клеток источником углерода и способствует увеличению биомассы, то стимуляция глутатионом потребления глюкозы также будет способствовать росту культуры.
Результаты изменения внутриклеточной концентрации глутатиона и растворимого клеточного белка после культивирования бактерий в течение 10 ч в отсутствие и в присутствии 08И
100
80-
60-
Т 40-
о ^
о s
V
0
1
-Glu (zero GSH)
■ Gly (zero GSH) -Cys (zero GSH) -Glu (+0,5 mM GSH)
■ Gly (+0,5 mM GSH)
■ Cys (+0,5 mM GSH)
120-
100
80
60
40
-Ala (zero GSH)
■ Val (zero GSH)
■ Leu (zero GSH) Ser (zero GSH)
■Ala (+0,5 mM GSH) ■Val (+0,5 mM GSH)
■ Leu (+0,5 mM GSH)
■ Ser (+0,5 mM GSH)
120-
100
80
60
40
■ Asp (zero GSH)
■ Met (zero GSH)
■ Thr (zero GSH)
■ Ile (zero GSH) Lys (zero GSH)
■ Asp (+0,5 mM GSH)
■ Met (+0,5 mM GSH)
■ Thr (+0,5 mM GSH)
■ Ile (+0,5 mM GSH)
■ Lys (+0,5 mM GSH)
10
120-1
100
80
60
40
20
■ Arg (zero GSH)
■ Phe (zero GSH) Tyr (zero GSH)
■ His (zero GSH) Pro (zero GSH)
■ Arg (+0,5 mM GSH)
■ Phe (+0,5 mM GSH)
■ Tyr (+0,5 mM GSH)
■ His (+0,5 mM GSH)
■ Pro (+0,5 mM GSH)
Время, ч
Рис. 3. Содержание различных свободных аминокислот в среде культивирования бактерий Ь. геМеп, выращенных в отсутствие и в присутствии 0,5 мМ
0
приведены на рис. 2, а и б соответственно. Глу-татион является предшественником синтеза макромолекул, а также участвует в образовании глутамата, глицина, аммония, сероводорода и пирувата. Некоторые из этих побочных продуктов и интермедиатов ферментации могут стимулировать рост клеток. Ранее было показано, что опрыскивание глутатионом ромашки (ЫаЫсагта екашошШа) приводило к увеличению высоты и сухой массы этого растения [13], что хорошо согласовывалось с нашими наблюдениями над бактериями Ь. гвШвп (см. выше). Ускорение роста в присутствии С8Н может объясняться тем фактом, что глутатион является источником редуцированной серы, поскольку содержит в своем составе цистеин, индуцирующий продукцию С8Н-синтетаз [14]. Мы показали, что в присутствии 0,5 мМ ¿8Н в культуральной среде уровень внутриклеточного глутатиона был в 1,34 раза выше, чем в его отсутствии. Это могло означать, что метаболиты экзогенного глутатиона быстро абсорбируются клетками Ь. гвШвп и используются для стимуляции пролиферации и биосинтеза собственного глутатиона. Помимо этого, мы обнаружили увеличение количества белка в клетках, выращенных в присутствии 0,5 мМ С8Н. Таким образом, стимуляция роста клеток Ь. гвШвп под действием глутатиона может являться результатом увеличения количества белка. Не исключено, что глутатион защищает клетки от кислотного стресса путем индукции адаптивных белков и регуляции белков энергетического метаболизма. Конечно, для окончательного подтверждения этого предположения требуется проведение сравнительных протеом-ных исследований клеток, содержащих различные концентрации глутатиона.
Для эффективного роста ЛБ в среде должны присутствовать все необходимые аминокислоты.
Для ответа на вопрос, влияет ли глутатион на поглощение клетками бактерий Ь. гвШвп свободных аминокислот (СА), мы определяли содержание семнадцати СА в культуральной среде в процессе выращива
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.