научная статья по теме ПОЛУЧЕНИЕ БЕЗМАРКЕРНЫХ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ Математика

Текст научной статьи на тему «ПОЛУЧЕНИЕ БЕЗМАРКЕРНЫХ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ»

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2009, том 426, № 2, с. 261-264

УДК 581.1:57.085:578.74:58.088:577.1

БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

ПОЛУЧЕНИЕ БЕЗМАРКЕРНЫХ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИИ

© 2009 г. Е. Б. Рукавцова, Н. С. Захарченко, С. В. Пиголева, А. А. Юхманова,

Е. Н. Чеботарева, Я. И. Бурьянов

Представлено академиком А.И. Мирошниковым 23.10.2008 г. Поступило 05.11.2008 г.

Для отбора трансгенных растений традиционно используют селективные гены устойчивости к антибиотикам и гербицидам [1] или гены-репортеры [2]. Используемые в настоящее время коммерческие трансгенные растения с устойчивостью к вредителям и гербицидам представляют существенную потенциальную биологическую и экологическую опасность, связанную с их негативным влиянием на полезные организмы агро-биоценозов. В связи с этим остро стоит проблема разработки методов получения трансгенных растений нового поколения без "генетического мусора", к которому относятся селективные гены устойчивости к антибиотикам и гербицидам и другие маркерные гены.

В настоящее время существует несколько стратегий удаления селективных маркеров из растений: метод котрансформации [3, 4], применение сайт-специфической рекомбинации на основе системы Cre/lox бактериофага P1 [5], использование векторной системы MAT [6]. Альтернативным методом является метод трансформации с использованием селективных генов для позитивной (ген неомицинфосфотрансферазы nptII) и негативной (ген цитозиндезаминазы codA) селекций на одной плазмиде и целевого гена - на другой [7].

Целью настоящей работы явилось получение биологически безопасных безмаркерных трансгенных растений для сельского хозяйства и фармакологии, отличающихся отсутствием у генов нежелательных побочных свойств. В задачу данной работы входила разработка методологии получения трансгенных растений - продуцентов поверхностного антигена вируса гепатита В без применения маркерных селективных генов. Другой задачей было получение безмаркерных растений с искусственным геном антимикробного пептида цекропина Р1 для повышения их устойчивости к фитопатогенам и изучение влияния экспрессии этого гена в растениях на их взаимо-

Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии наук, Пущино Московской обл.

действие с полезными ассоциативными микроорганизмами.

Плазмида рВМ, не содержащая маркерных генов для отбора трансгенных растений, получена на основе бинарного вектора для трансформации растений рВ1М9 [8]. Из этого вектора был удален маркерный ген устойчивости к канамицину прШ вместе с промотором и сигналом полиаденилирования аг-робактериального гена нопалинсинтазы (рис. 1). Плазмида рВМ содержит практически полностью сохранившийся полилинкер вектора рВ1М9 с различными сайтами для клонирования генов и последовательности ЬВ и ЯВ агробактериальной Т-ДНК, необходимые для ее интеграции в растительный геном. В плазмиде рВМ присутствует

R, K, Sm, B, Sl, S

Рис. 1. Схема плазмиды рВМ. Обозначения: опУ - начало репликации; Со1Е1 - начало репликации из плазмиды Со1Е1; КтЯ - ген устойчивости к антибиотику канамицину для селекции бактерий; ТЬ, ТЯ - левая и правая границы Т-ДНК; Я, К, 8т, В, 81, 8 - сайты рестрикции ЕсоЫ, Крп1, 8та1, ВатН1, 8а11, 8рЫ.

Рис. 2. Анализ ингибирующей активности растительных экстрактов (из 50 эксплантов разных растений в одной лунке агарового блока) на рост клеток Е. саго-Шуога.

ген устойчивости к канамицину прЙП для отбора бактериальных клеток, однако он расположен вне области Т-ДНК и не включается в геном растений. В эту плазмиду по сайту БрЫ встраивали ген поверхностного антигена вируса гепатита В (НВзА§) под контролем двойного промотора 35Б РНК вируса мозаики цветной капусты [9]. Полученную плазмиду рВМ-А§ перенесли в штамм А. tumefaciens ЬВА4404 (рАЬ4404), который использовали для трансформации листовых эксплантов табака.

Для отбора трансгенных растений с геном НВвА§ применяли метод иммуноферментного анализа, позволяющий определять в экстрактах трансгенных растений НВвА§ в концентрации 0.5 нг/мл. Полученные нами ранее трансгенные растения табака и картофеля с селективным геном прШ синтезировали НВвА§ на среднем уровне около 0.02% от общего растворимого белка клетки, соответствующем его содержанию около 1 мкг/г сырой массы растений [9]. Это позволяет детектировать присутствие НВвА§ даже при 2000-кратном его разбавлении экстрактами нетрансформированных растений. Для анализа отбирали приблизительно равные по массе (около 0.5 г) экспланты проростков, которые объединяли, разрушали и определяли в их экстрактах присутствие НВвА§.

В выборках из 600 регенерантов табака, первоначально разбитых на группы, представляющие смесь эксплантов из 20-60 проростков, присутствие НВвА§ постоянно выявлялось в нескольких группах. Дальнейшее дробление каждой группы по принципу "поиска фальшивой монеты" или прямое тестирование всех присутствующих в группе регенерантов делает возможным нахождение индивидуальных трансформантов, синтезирующих НВвА§. В некоторых случаях в положительно детектируемой НВв-группе было выявлено

до 3-5 индивидуальных трансформированных растений. Эффективность трансформации определяли как процентную долю НВв-положительных регенерированных проростков по отношению ко всем регенерантам. С помощью проведенного иммуноферментного анализа отобраны 15 линий трансгенных растений табака без селективных маркеров, синтезирующих антиген на уровне 0.010.05% от общего растворимого белка. Эффективность трансформации составила 2.5%.

Наблюдаемая в наших экспериментах достаточная для практической селекции частота трансформации может быть результатом положительного влияния двух новых факторов примененного метода. Во-первых, отбор трансгенных растений на среде без антибиотиков создает условия для нормального роста и развития растений без аномального изменения метилирования их генома и при сохранении его эпигенетического статуса [10]. Во-вторых, в примененном методе трансформации растений использован сконструированный нами вектор с Т-ДНК, укороченной на 2600 п.о., что снижает нежелательный эффект длинных вспомогательных векторных последовательностей на плотность упаковки ДНК в хроматин и соответственно на экспрессию целевого гена [11].

В дальнейшем для трансформации растений томата и табака безмаркерной генетической конструкцией рВМ-А§ нами был применен метод вакуумной инфильтрации семян в суспензии агро-бактерий. После трансформации семена проращивали на среде МС с цефотаксимом и через 1014 дней в проростках определяли наличие НВвА§ с помощью ИФА. В результате получено несколько линий растений табака и томата, синтезирующих НВвА§ на уровне до 0.05% от общего растворимого белка. Метод трансформации семян оказался экономичным по времени отбора трансформантов и позволил нам повысить частоту агробактериальной трансформации до 15-20%.

С применением сконструированного нами вектора рВМ разработаны методы получения безмаркерных трансгенных растений, экспрессиру-ющих ген антимикробного пептида цекропина Р1. Для клонирования нами использован искусственный ген сесР1 под промотором 35Б РНК вируса мозаики цветной капусты [12]. Полученную конструкцию рВМ-сесР1 перенесли в штамм А. tumefaciens ЬВА4404 (рАЬ4404), который использовали для трансформации листовых эксплантов табака. Для поиска трансформированных растений брали по одному листовому экс-планту у каждого из 50 регенерантов, их объединяли в группы (всего 40 групп) и использовали для приготовления исходных тестируемых образцов растительного экстракта. Антибактериальную активность исследуемого суммарного экстракта оценивали по наличию зоны отсут-

ПОЛУЧЕНИЕ БЕЗМАРКЕРНЫХ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ

263

ствия роста бактерий Erwinia carotovora на агари-зованной среде вокруг лунок (рис. 2).

В этом эксперименте в девятнадцати группах из сорока была обнаружена антибактериальная активность. Дальнейший прямой поиск в этих группах индивидуальных растений, синтезирующих антимикробный пептид цекропин Р1, проводили методом иммуноферментного анализа. Для этого растения трех таких групп пересаживали в отдельные пробирки, подращивали в течение трех недель и проводили вестерн-блот-анализ экстрактов из листьев, содержащих около 100 мкг общего белка. В экстрактах некоторых растений был обнаружен искомый пептид с молекулярной массой 3.4 кДа, соответствующий зрелой форме цекропина Р1 (рис. 3).

В каждой из трех исследованных групп было выявлено от одного до трех cecPl-положительных растений. В группах с антибактериальной активностью из общего количества 150 индивидуальных растений цекропин Р1 был выявлен у шести таких растений.

Эффективность выявления трансформированных регенерантов двумя использованными методами составляет около 2%. Чувствительность этих методов позволяет детектировать в образцах экстрактов трансгенных растений цекропин Р1 в количестве 1-10 нг. Полученные сесР1-рас-тения синтезировали цекропин Р1 на среднем уровне около 0.005% от общего растворимого белка клетки, что делает возможным надежное применение использованных нами методов обнаружения таких растений в выборке из нескольких сотен регенерантов.

Полученные трансгенные растения, экспресси-рующие синтетический ген цекропина Р1, проверяли на устойчивость к некоторым бактериальным и грибным фитопатогенам. Анализ трансгенных растений показал значительное повышение их устойчивости к бактерии E. carotovora и грибу Sclerotinia sclerotiorum.

Способность экспрессируемого гена цекропина Р1 существенно повышать устойчивость растений к микробным патогенам создает предпосылки его одновременного использования как в виде целевого гена, так и в качестве скринингового маркера. Кроме того, имеются предпосылки для разработки метода его применения в качестве селективного гена, позволяющего вести прямой отбор трансформированных растений по их устойчивости тест-патогенам.

Проведено исследование экологической безопасности полученных растений. Известно, что растения состоят в тесной ассоциации с различными полезными колонизирующими микроорганизмами. Разрушение этой ассоциации может привести к существенным отрицательным экологиче

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Математика»