ОНТОГЕНЕЗ, 2013, том 44, № 6, с. 403-408
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЭМБРИОЛОГИЯ
УДК 591.39:535
ПОЛУЧЕНИЕ ХИМЕРНЫХ БЛАСТОЦИСТ МЫШИ МЕТОДАМИ
ЛАЗЕРНОЙ НАНОХИРУРГИИ
© 2013 г. А. К. Шахбазян1,2, В. З. Тарантул3, А. Д. Залесский1, А. В. Рябова4, В. Б. Лощенов4, С. А. Антоновз, И. А. Гривенников®, А. С. Кривохарченко5, А. В. Карменян6, В. А. Надточенко1
Институт химической физики РАН 119991 Москва, ул. Косыгина, 4 2Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3 3Институт молекулярной генетики РАН 123182 Москва, пл. Академика Курчатова, д. 2 4Институт общей физики им. А.М. Прохорова РАН 119991, Москва, ул. Вавилова, 38 5 Max-Delbruck Center for Molecular Medicine Robert-Rossle-Str. 10, Berlin, 13092 Germany 6 Biophotonics and Molecular Imaging Research Center (BMIRC) National Yang-Ming University,
Taipei, R.O.C., 11221 Taiwan E-mail: avetik@rambler.ru Поступила в редакцию 13.06.13 г. Окончательный вариант получен 24.06.13 г.
Описано получение химерных бластоцист мыши методами лазерной нанохирургии без использования какой-либо другой дополнительной техники. Для проведения экспериментов был разработан и сконструирован специальный лазерный микроманипулятор. В экспериментах использовали эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) мыши, трансформированные вектором pEF-GFP, кодирующим флуоресцирующий зеленый белок. ЭСК с помощью лазерного микроманипулятора вводили в перивителлиновое пространство мышиных эмбрионов на стадии 8-и клеток. Оперированные эмбрионы культивировали in vitro до стадии вылупления из zona pellucida. Наличие флуоресценции и ее точную локализацию регистрировали на конфокальном микроскопе. Впервые было продемонстрировано, что включения введенных лазерным микроманипулятором ЭСК, обнаруживаются как во внутренней клеточной массе (ВКМ), так и в трофэктодерме химерной бластоцисты. Технология проведения нанохирургических операций на ранних доимплантационных эмбрионах млекопитающих с помощью лазерной техники открывает большие возможности не только для решения фундаментальных задач экспериментальной эмбриологии млекопитающих, но эта технология также может быть использована как перспективный метод получения химерных и трансгенных животных с заданным экспериментаторами генотипом.
Ключевые слова: лазерная нанохирургия, доимплантационные эмбрионы млекопитающих, эмбриональные стволовые клетки, зеленый флуоресцирующий белок, химерные бластоцисты.
DOI: 10.7868/S0475145013060104
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время все работы связанные с получением генетически модифицированных млекопитающих путем введения эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в доимплантационные эмбрионы (в основном на стадии бластоцисты), осуществляются главным образом с применением традиционных подходов (агрегация клеток, микроинъекции) (№§у й а1., 2003), а в последние годы с использова-
нием пьезомикроманипуляторов (Ни й а1., 2013). Одновременно с этим активно развиваются новые технологии, связанные с использованием лазеров для манипуляций различными биологическими объектами, в том числе с клетками и ранними доим-плантационными эмбрионами млекопитающих (Кагтепуап й а1., 2009; КлуокЬагсИепко й а1., 2012). В данной работе впервые продемонстрирована возможность получения химерных бластоцист мыши с
Рис. 1. Принципиальная оптическая схема, использованная в эксперименте: 1 — титан-сапфировый лазер непрерывного излучения в диапазоне 750—850 нм фирмы Лув81а; 2 — телескоп — расширитель лазерного пучка; 3 — диодный лазер; 4 — три дихроичных зеркала; 5 — объектив микроскопа; 6 — предметный столик; 7 — источник освещения; 8 — флу-ориметр/счетчик фотонов; 9 — видеокамера.
применением усовершенствованной лазерной на-нохирургии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали как оригинальные, специально разработанные для данных экспериментов методы и подходы, так и стандартные, применяемые в клеточной биологии и клеточной инженерии.
Получение эмбрионов
Для экспериментов эмбрионы получали от су-перовулированных самок мышей линии C57BL/6, спаренных с самцами линии CBA. Суперовуляцию проводили по стандартной схеме с использованием гонадотропина сыворотки жеребых кобыл (PMSG, Intervet) и человеческого хорионического гонадотропина (hCG, Intervet). Животных умерщвляли путем дислокации шейных позвонков. Эмбрионы получали путем промывания яйцеводов. Все манипуляции с эмбрионами проводили в среде М2 (Sigma), для длительного культивирования использовали среду М16 (Sigma), СО2 инкубатор (Sanyo) и 4-лу-ночные пластиковые чашки "Nunclon" (Nunc).
Лазерный микроманипулятор
Микрохирургические операции были выполнены на установке мультиплексного лазерного манипулятора разработанного в ИХФ РАН. Принципи-
альная схема оптического блока использованного в эксперименте представлена на рис. 1.
В данной работе в мультиплексном лазерном манипуляторе использовали инвертированный оптический микроскоп (Olympus IX71). В поле микроскопа через объектив с высокой числовой апертурой заводили лазерное излучение от двух лазеров. Использовали объективы ЛОМО М-ФЛЮАР 100х/1.3 или Olympus LCAch N 40x/0.55 Ph2. Сфокусированное излучение титан-сапфирового непрерывного лазера 790 нм в предметной плоскости, где находится исследуемый образец, выполняло роль "оптического пинцета". Пространственные манипуляции над клетками проводили путем их перемещения относительно фокального пятна при движении предметного столика. Перемещение предметного столика осуществляли либо "вручную" либо с помощью позиционных пьезо-двигате-лей, причем, в последнем случае, обеспечивается точность перемещений близкая к десяти нанометрам. Непрерывный диодный лазер с контролируемой экспозицией, длина волны 1.48 мкм, мощность в поле микроскопа 80 мВт использовали для проведения микрохирургических операций с блестящей оболочкой эмбриона и получения отверстия с размером около 10 мкм. Визуальный контроль осуществлялся с помощью видеокамеры (Sony ExwaveHAD). Установка также была оснащена спектрометром с фотоприемниками для регистрации спектров флуоресценции объекта исследования.
ПОЛУЧЕНИЕ ХИМЕРНЫХ БЛАСТОЦИСТ МЫШИ
405
Культура эмбриональных стволовых клеток
ЭСК мыши линии R1 культивировались в среде а-МЕМ (аЬсо, США), с 15% фетальной бычьей сывороткой, 2 мМ L-глутамина, и добавками 20 мкМ смеси витаминов, 100 мкМ заменимых аминокислот, 100 мкМ пирувата натрия, 80 мкМ меркаптоэтанола (ГС^ США) и 20 мкг/мл гента-мицина. ЭСК культивировались в чашках Петри, которые обрабатывались 0.1% желатином, или на чашках с фидерным слоем эмбриональных фиброб-ластов мыши. При культивировании ЭСК на чашках покрытых желатином, в культуральную среду также добавлялся рекомбинантный LIF в концентрации 10 нг/мл. Эмбриональные фибробласты мыши выделялись из 13—14 дневных эмбрионов мыши 129 линии по стандартной методике. Фиб-робласты культивировались на чашках Петри диаметром 35 мм в среде DMEM (^Ьсо, США) с 10% фетальной бычьей сыворотки, 2мМ L-глутамина (ГС^ США) и 80 мкг/мл гентамицина. Для получение фидерного слоя фибробласты обрабатывались митомицином С (1.5 часа, 3 мкг/мл) в ростовой среде и после этого три раза отмывались раствором Хенкса. На следующий день фидерные слои использовались для посева ЭСК. Все клеточные культуры поддерживались в С02 инкубаторе в атмосфере 5% С02 и при температуре 37°С.
Конструирование вектора
Вектор pEF-GFP был получен на основе коммерчески доступного вектора pcEGFP-C1 (1пуйго-§еп, США), несущего ген устойчивости к селективному антибиотику неомицину. Последовательность промотора фактора элонгации Р EF1A была получена из вектора pBudCE4.1 с помощью рестрикции по сайтам Мке1/ХИо1 и клонирована по липким концам в промежуточный вектор pSPT18. Конечный вектор рестрицирован В§1П/Н1^Ш, при этом вырезался фрагмент промотора Р СМУ. Далее pSPT18 была рестрицирована по ВатН1/ и фрагмент P EF1A клонирован в вектор pcEGFP-C1 по сайтам В§1П/НМШ.
Характеристика клеток линии R1-EF-GFP
Трансфекцию ЭСК проводили липосомальным методом с помощью метафектена (В1оТех, Германия). Для трансфекции использовали 1 мкг плаз-мидной ДНК на 600 000 клеток и 3 мкл метафектена на 1 мл среды. Клетки инкубировали 2 ч при 37°С в С02 инкубаторе. Затем к клеткам добавляли еще 2 мл среды и продолжали инкубацию в течение 2-х суток в тех же условиях. Потом к клеткам добавляли неомицин в концентрации 20 мкг/мл для
селекции трансфицированных клеток. Селекцию проводили в течение 10—14 дней со сменой среды с антибиотиком каждые три дня. Клетки, экспресси-рующие GFP, наращивали, а затем подвергали криоконсервации. Из трансфицированных клеток выделялась тотальная РНК и анализировалась экспрессия транскрипционных факторов Nanog, SOX2, OCT4 c помощью ПЦР, сопряженной с обратной транскрипцией. По экспрессии факторов плюрипотентности между клетками исходной линии R1 и трансгенными клетками R1-EF-GFP различий не обнаруживалось. Также проводилось ка-риотипирование клеток и анализ экспрессии поверхностных маркеров, таких как щелочная фосфатаза (AP) и SSEA-1 (CD15/Lewis-X).
Конфокальная микроскопия
Локализацию флуоресценции на вылупляющихся бластоцистах фиксировали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM-710 (Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany). Образцы из чашек для in vitro культивирования переносились на стерильные чашки Петри с тонким стеклянным дном толщиной 0.16 мм в среде для манипуляций М2. Для получения изображений использовали объектив Plan-Apochromat с увеличением 20х (апертура 0.8). Возбуждение флуоресцентного белка производили лазером с длиной волны 458 нм и максимальной плотностью мощности 25 мВт, регистрировали флуоресценцию в диапазоне 460—600 нм при конфокальной диафрагме диаметром 151 цм, размер изображений — 1024 х х 1024 пикселей (159 нм/пиксель), скорость сканирования 1.27 цс/пиксель (1.56 с/изображение). Для получения 3D реконструкции проводили сканирование по оси Z с шагом 1 цм. В результате получали наложение 3D реконструкций флуоресцентного изображения и изображения, полученного в режиме проходящего света.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для проведения экспериментов эмбрионы выделяли из яйцево
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.