ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 4, с. 600-606
УДК 581.19:577.175.12
ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ АГРОБАКТЕРИАЛЬНЫЙ ГЕН ТРИПТОФАНМОНООКСИГЕНАЗЫ
© 2004 г. В. В. Алексеева, Е. Б. Рукавцова, М. Е. Бобрешова, В. Н. Ложникова*, Я. И. Бурьянов
Филиал Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Пущино, Московская обл.
* Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 25.06.2003 г.
Экспрессия агробактериального гена триптофанмонооксигеназы iaaM, катализирующей первый этап синтеза ауксинов, вызывала значительные физиологические и биохимические изменения в трансгенных растениях табака (Nicotiana tabacum L.). Все полученные линии трансгенных растений in vitro имели аномальный фенотип, проявляющийся в усиленном корнеобразовании, появлении придаточных корней на стеблях, скрученности листьев. В условиях in vivo у трансгенных растений наблюдали аномальный, промежуточный или нормальный фенотипы. У растений аномального фенотипа в условиях закрытого грунта обнаружено наибольшее содержание свободных ауксинов в листьях, снижение репродуктивных свойств, потеря всхожести семян, увеличение количества придаточных корней. Трансгенные растения нормального фенотипа мало отличались по морфологическим признакам от контрольных, и содержание свободных ауксинов в таких растениях было ниже, чем в растениях аномального фенотипа. У растений промежуточного фенотипа в условиях in vivo происходила потеря ряда морфологических свойств, характерных для растений аномального фенотипа. Только растения нормального и промежуточного фенотипов имели семена с высокой всхожестью.
Nicotiana tabacum - трансформация- ауксины - триптофанмонооксигеназа - iaaM
Ауксины - одни из ключевых гормонов растений. При экзогенном применении ауксинов было показано, что они участвуют в регуляции роста, цветения, фото- и геотропизма, вторичного роста стебля в толщину, стимулируют образование придаточных корней, тормозят рост боковых почек, ускоряют рост плодов, влияют на клубнеобразо-вание. Характер влияния ауксинов зависит от возраста растения, концентрации гормона, вида растения, и особенно от типа ткани [1, 2]. В последние годы получило развитие новое направление исследования ауксинов, связанное с изменением эндогенного уровня этих гормонов. При этом в качестве модели все чаще используют трансгенные растения с измененным балансом фитогор-монов, а также различные формы растений, му-тантные по синтезу гормонов [3]. Такие растения
Сокращения: ИАМ - индолилацетамид; ПЦР - полимераз-ная цепная реакция.
Адрес для корреспонденции: Рукавцова Елена Борисовна. 142290 Московская обл., Пущино, пр. Науки, 6. Филиал Института биоорганической химии РАН. Факс: 07 (0967) 79-05-27; электронная почта: ruk@fibkh.serpukhov.su
представляют собой удобную модель для изучения метаболизма ауксинов, их взаимодействия с другими гормонами, роли ауксинов в регуляции процессов роста, цветения и репродуктивности растений.
Как известно, центральное место среди ауксинов занимает ИУК. Основным предшественником ИУК в растениях является триптофан, хотя в качестве предшественников могут выступать и другие индолы [3, 4]. Синтез ИУК широко распространен также среди бактерий. Так, у фитопа-тогенной бактерии Agrobacterium Штв/аЫвш синтез ИУК осуществляется из триптофана при участии двух ферментов, кодируемых генами iaaM и iaaH [3]. Ключевым ферментом этого биосинтеза является триптофанмонооксигеназа, кодируемая геном iaaM и превращающая триптофан в индолилацетамид (ИАМ). В настоящей работе были получены и исследованы трансгенные растения табака, содержащие агробактериальный ген iaaM под контролем мощного конститутивного двойного промотора 35Б РНК вируса мозаики цветной капусты.
МЕТОДИКА
Конструирование плазмид для трансформации растений. Источником гена iaaM послужила плаз-мида pDQ14, содержащая последовательность гена iaaM размером 2270 п. н. из октопиновой Ti-плазмиды pTiA6NC [5]. На оба конца гена методом ПЦР был введен сайт рестриктазы Cfr9I, входящий в состав олигонуклеотидных праймеров:
1) CGCCCGGGCTAATTTCTAGTGCGGTAGTT и
2) CGCCCGGGATGTCACCTTCACCTCT. Условия ПЦР были следующие: 94°C - 5 мин; 30 циклов: 94°C - 30 с, 61°C - 30 с, 72°C - 2 мин, затем 72°C -7 мин на амплификаторе Gene Amp® PCR System 2400 ("Perkin-Elmer", США).
ПЦР-продукт гена обрабатывали ферментом Cfr9I и сшивали с помощью ДНК лигазы фага Т4 с плазмидой pBluescriptIIKS+, гидролизованной по тому же сайту рестрикции. Полученной смесью трансформировали клетки E. coli TG2 [6]. Плазмидную ДНК отобранных клонов с геном iaaM гидролизовали эндонуклеазой рестрикции Cfr9I и полученный фрагмент ДНК встраивали в бинарный вектор pSS [7], гидролизованный ферментом Cfr9I. Ориентацию гена по отношению к промотору определяли гидролизом ДНК по сайту рестрикции BamHI. Конструкцию с геном iaaM, а также плазмиду pSS без вставки, переносили в штамм A. tumefaciens GV3101 (pMP90RK) методом прямой трансформации [8]. Анализ ДНК полученных клонов проводили методом гибридизации по Саузерну с меченным 32P ПЦР-продуктом гена iaaM [6].
Трансформация растений. Полученными аг-робактериальными штаммами трансформировали листовые диски табака (Nicotiana tabacum L.) сорта Самсун. Растения выращивали в 0.5-1 л культуральных сосудах на агаризованной МС среде [9] без фитогормонов при 24-26°C, освещенности 2 клк и относительной влажности воздуха 65%. Трансформацию листовых дисков проводили по стандартной методике [10].
Количество белка определяли по методу Bradford [11]. Экстракцию общего белка проводили в буфере, содержащем 0.5 мМ ЭДТА, 50 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 50 мМ NaCl, 2 мМ фенилметилсуль-фонилфторид, 0.05% Твин-20.
Определение содержания хлорофилла и каро-тиноидов проводили спектрофотометрически, согласно стандартной методике [12].
Экстракция и очистка ауксинов из растительного материала. Ауксины экстрагировали из листьев (10-20 г) пятью объемами 80%-ного метанола, содержащего 10 мг/л бутилированного гидро-кситолуола в течение ночи при 4°C в темноте. После повторения процедуры экстракты объединяли и фильтровали. Неэкстрагированный материал высушивали при 65°C в течение ночи и использовали для определения сухого веса, а филь-
трат упаривали на роторном испарителе при 45°C до водной фазы. Ауксины экстрагировали диэти-лацетатом из водной фазы, подкисленной до pH 3.0 с помощью 1 N HCl, упаривали при 45°C и растворяли в 96%-ном этаноле. Спиртовый экстракт разделяли восходящей хроматографией на бумаге (Ленинградская № 1) в системе (н-)бута-нол : ледяная уксусная кислота-вода (40 : 12 : 28). Экстракцию ИУК R 0.6-0.9) проводили 96%-ным этанолом.
Биотест на содержание ауксинов. Влияние ауксинов на растяжение отрезков колеоптилей используется в биотестах на этот гормон [13]. Биотест проводили на колеоптилях пшеницы сорта Приокская. Для построения калибровочной кривой применяли растворы ИУК в концентрациях от 5 х 10-8 до 7 х 10-3 М.
Выделение ДНК из листьев табака проводили по методу Edwards с соавт. [14]. Полученную растительную ДНК использовали в качестве матрицы в ПЦР. Праймерами для гена nptII служили олигонуклеотиды, специфичные для внутреннего фрагмента гена размером 600 п. н. [15].
Выделение РНК из листьев табака для РНК-ДНК гибридизации проводили с использованием горячего фенола по методу [16]. Электрофорез рНк проводили в 4%-ном полиакриламидном геле, содержащем 6 М мочевину [17]. Разделенную РНК переносили на нейлоновый фильтр Hybond N+ ("Amersham", Великобритания) электроблот-тингом c помощью прибора Transblot ("Bio-Rad", США) в течение ночи при 20 В. Гибридизацию РНК с меченным 32Р ДНК фрагментом гена iaaM проводили в условиях, описанных в работе [18].
Анализ устьиц. На нижнюю поверхность листа наносили тонкий слой бесцветного лака. Лист отделяли от стебля и осторожно снимали тонкую пленку застывшего лака. Полученные реплики использовали для анализа количества и состояния устьиц при помощи светового микроскопа. Измерения проводили в трех биологических и трех аналитических повторностях. В таблицах и на рисунках приведены средние значения и их стандартные отклонения.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Агробактериальный ген триптофанмоноокси-геназы iaaM, отвечающий за первый этап биосинтеза ИУК, клонировали в бинарный растительный вектор pSS под двойной промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35S) (рис. 1). В отличие от других работ, где экспрессия гена iaaM в трансгенных растениях получена под относительно слабыми промоторами [19-22], в настоящей работе экспрессию гена контролировали с помощью более мощного конститутивного промотора. После трансформации листовых
HindIII
Cfr 9I
Cfr 9I
LB
P 35SS
iaaM
HindIII -L- RB poly A
Рис. 1. Схема плазмиды, содержащей ген iaaM. Обозначения: P 35SS - двойной промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты СаМУ; LB и RB -левая и правая границы Т-ДНК.
(а)
-2270 п.н.
1 2 3 4 5 6 (б)
600 п.н.
Рис. 2. ПЦР-анализ ДНК трансгенных растений табака с использованием специфических праймеров для гена iaaM (а) и внутреннего фрагмента гена nptII (б). 1 - маркерная ДНК: (а) - риС/£соЫ1, (2073 п.н.), (б) -pBR322/HaeII, (622, 439 п.н.); 2 - ДНК нетрансформи-рованного растения; 3-6 - ДНК трансгенных расте-
>-2270 п.н.
Рис. 3. Анализ мРНК гена iaaM в трансгенных растениях табака методом РНК-ДНК гибридизации. В качестве зонда использовали меченный 32Р фрагмент ДНК гена iaaM: 1 - положительный контроль, ДНК фрагмент гена iaaM; 2 - РНК из контрольного табака; 3-7 - РНК из трансгенных растений табака с геном iaaM.
эксплантов генетической конструкцией с геном iaaM трансгенные побеги астенического фенотипа сформировались спустя два месяца, что может указывать на повышение в них концентрации ауксинов. В то же время, трансформация растений "пустым" вектором рББ приводила к образованию трансгенных побегов уже через месяц. Эти растения, экспрессирующие только ген пр^1, использовали в качестве контрольных.
Наличие генов iaaM и прШ в геноме полученных растений было доказано мет
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.