ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2012, том 59, № 5, с. 701-709
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА УСТОЙЧИВОЙ К АМИНОТРИАЗОЛУ ЛИНИИ МОРФОГЕННОГО КАЛЛУСА Fagopyrum гагапеит
© 2012 г. Г. В. Сибгатуллина, Н. И. Румянцева, Л. Р. Хаертдинова, А. Н. Акулов,
Н. Б. Тарасова, Е. А. Гумерова
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Казанский институт биохимии и биофизики
Казанского научного центра РАН, Казань Поступила в редакцию 05.05.2011 г.
Показано, что ингибитор каталазы 3-амино-1,2,4-триазол (АТ) в концентрации 2 мМ оказывал разное действие на рост различающихся по морфогенной активности каллусных культур гречихи татарской (Fagopyrum ?Шапеиш (Ь.) ОаегШ.). В одних случаях АТ вызывал гибель значительной части клеток неморфогенного каллуса, в других ингибировал рост и снижал жизнеспособность морфо-генного каллуса. Гибель клеток неморфогенного каллуса могла быть связана с накоплением перекиси водорода и развитием окислительного стресса. После воздействия АТ на морфогенный каллус получили измененную морфогенную линию 1-8 АТ, устойчивую к действию АТ и отличающуюся от исходной линии по морфологии, размеру клеток, пролиферативной активности и некоторым биохимическим характеристикам. В линии 1-8 АТ каталаза была чувствительна к действию этого ингибитора. При этом подавление активности каталазы АТ не вызывало увеличения содержания перекиси водорода в клетках, что может свидетельствовать о компенсаторном функционировании другого/других механизмов, способствующих разрушению перекиси водорода.
Ключевые слова: Fagopyrum (а(апеит - морфогенный каллус — неморфогенный каллус - 3-амино-1,2,4-триазол — каталаза - перекись водорода - окислительный стресс - устойчивость к аминотриазолу
ВВЕДЕНИЕ
Устойчивость культивируемых клеток растений к окислительному стрессу может служить фактором, обуславливающим стабильность их регенерационного потенциала, поскольку работами последнего десятилетия показано, что редокс-статус играет существенную роль в регуляции морфогенеза растений [1]. Высказано предположение [2], что потеря регенерационной способности в каллусах и суспензиях при длительном культивировании может быть связана с негативным влиянием на генетический аппарат клеток активных форм кислорода (АФК), образование которых индуцируется условиями культивирования in vitro. Ранее нами было установлено, что морфогенные каллусы гречихи татарской способны к длительному сохранению регенерационного потенциала [3]. Кроме того, было показано, что морфогенные каллусы гречихи татарской, по сравнению с неморфогенными каллусами, характеризуются высокой активно-
Сокращения: АПО — аскорбатпероксидаза; АТ — 3-амино-1,2,4-триазол; ДФПГ - 2,2-дифенил-1-пикрилгидрозил; МИ - митотический индекс; ОЗДГ - оксоглутарат-зависи-мая диоксигеназа; ПЭКК — проэмбриональный клеточный комплекс; ТБК - тиобарбитуровая кислота; ФМСФ — фе-нилметилсульфонилфторид.
Адрес для корреспонденции: Румянцева Наталья Ивановна. 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31, а/я 30. Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН. Электронная почта: nat_rumyantseva@mail.ru
стью каталазы, низкой активностью супероксид-дисмутазы и низким содержанием внутриклеточной перекиси водорода и продукта перекисного окисления липидов - малонового диальдегида [4]. Специфический ингибитор каталазы - 3-ами-но-1,2,4-триазол (АТ) - часто используют для индукции окислительного стресса как у целых растений, так и у культивируемых клеток [5, 6]. АТ быстро проникает в клетки [5] и инактивирует ка-талазу, вызывая увеличение внутриклеточного содержания перекиси водорода [6].
В связи с этим, представлялось необходимым изучить устойчивость двух типов каллуса, различающихся по морфогенной активности, к действию специфического ингибитора каталазы (АТ).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал. В работе использовали морфогенный каллус линии 1-8 и полученный из него неморфогенный каллус линии 1-8р гречихи татарской (Fagopyrum 1а1апеит (Ь.) Gaertn.). Морфология и получение таких культур были описаны нами ранее [3]. Каллусные культуры поддерживали в термостате при температуре 26 ± 2°С в темноте на каллусогенной среде ЯХ [3], содержавшей минеральные соли среды Гамборга В5 (Gamborg с соавт. [7]) с добавлением 2 мг/л тиа-
мина-HCl, 1 мг/л пиридоксина-HCl, 1 мг/л никотиновой кислоты, 2 г/л гидролизата казеина, 2 мг/л 2,4-Д, 0.5 мг/л ИУК, 0.5 мг/л нафтилуксус-ной кислоты, 0.2 мг/л кинетина. Неморфогенные каллусы пересаживали через каждые 2 нед., а морфогенные — через каждые 4 нед. Перед добавлением в среду культивирования ингибитор ката-лазы АТ стерилизовали, пропуская через стерильный ультрафильтр с диаметром пор 0.22 мкм ("Mil-lipore", США). Исходя из литературных данных [810], мы выбрали концентрацию АТ 2 мМ. О характере роста каллусной культуры судили по приросту свежей массы ткани за определенные периоды времени. Соматический эмбриогенез индуцировали на безгормональной среде МС [11]; каллусы культивировали на свету (5 клк) в условиях 16-часового фотопериода и температуры 25°С.
Определение митотического индекса. Для приготовления цитологических препаратов и подсчета митотического индекса (МИ) каллус фиксировали в смеси этанола и уксусной кислоты (3 : 1) в течение 4-6 ч. Отмывали материал от фиксатора 96% этанолом и хранили в 70% этаноле.
Окрашивание хромосом проводили 2% пропи-оновым орсеином ("Sigma-Aldrich", Германия). Препараты просматривали под микроскопом Je-named ("Саг! Zeiss", Германия), фотографировали и измеряли размеры клеток с помощью цифровой насадки AxioCam MRc5 с программным обеспечением Axio Vision ("Сай Zeiss"). При определении МИ учитывали не менее 5000 клеток на точку фиксации.
Содержание перекиси водорода определяли спектрофотометрически, согласно Bellincampi с соавт. [12]. 200-300 мг каллусной ткани растирали с 1.0-1.5 мл сильно охлажденного ацетона, и полученный гомогенат центрифугировали (5 мин, 12000 g). Затем отбирали супернатант и использовали его для анализа. В пробирки вносили равные объемы полученной вытяжки и реактива, содержавшего: 0.5 мМ FeSO4(NH4)2SO4, 50 мМ ксиле-нолового оранжевого, 200 мМ сорбита, 50 мМ H2SO4. Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре Lambda 25 ("Perkin Elmer", США) при длине волны 560 нм, используя в качестве контроля смесь, состоявшую из равных частей реактива и чистого растворителя. Содержание перекиси водорода определяли по калибровочной кривой, построенной с использованием известных концентраций перекиси водорода.
Для определения активности каталазы (КФ 1.11.1.6) использовали спектрофотометри-ческий метод, предложенный АеЫ с соавт. [13]. Метод основан на определении скорости разложения перекиси водорода каталазой исследуемого образца с образованием воды и кислорода. Навеску каллусной ткани растирали в охлажденной ступке в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7.8, с до-
бавлением 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ). Гомогенат центрифугировали 5 мин при 12000 g, затем фильтровали через ультрафильтр "Millipore" с диаметром пор 0.22 мкм. Активность каталазы определяли по изменению адсорбции при 240 нм, обусловленном разложением перекиси водорода. Реакционная смесь содержала 2.978 мл буфера (рН 7.0) и 0.005 мл экстракта. Реакцию запускали добавлением 0.02 мл 0.6 М перекиси водорода.
За накоплением продукта перекисного окисления липидов — малонового диальдегида (МДА) — следили по реакции с тиобарбитуровой кислотой (4,6-дигидрокси-2-меркаптопиримидин, ТБК) [14]. 500 мг каллусной ткани растирали с 1.01.5 мл 1% Тритона Х-100, полученный гомогенат центрифугировали (5 мин, 12000 g). Затем отбирали супернатант и использовали его для анализа. В пробирку с 0.5 мл супернатанта последовательно добавляли 0.5 мл 1% Тритона Х-100, 0.2 мл 0.6 М НС1 и 0.8 мл 0.06 М рабочего раствора ТБК (864 мг ТБК растворяли в 100 мл 1% Тритона Х-100 с 50% этанолом). Пробирку со смесью нагревали на кипящей водяной бане в течение 15 мин; охлаждение смеси проводили при температуре 15°С в течение 30 мин. Для стабилизации окраски в смесь после охлаждения добавляли 0.1 мл 5 мМ ЭДТА и 1 мл 96% этанола. Контролем служила смесь тех же растворов, но без добавления ТБК. Измерения проводили при длине волны 532 нм, а также при 600 нм для корректировки неспецифического поглощения. Для вычисления содержания МДА использовали коэффициент экстинк-ции е = 155/(мМ см).
Активность аскорбатпероксидазы (КФ 1.11.1.7)
определяли, как описано Verma и Dubey [15]. Навеску каллусной ткани (150 мг) растирали в 50 мМ К-фосфатном буфере (рН 7.8), содержавшим 1 мМ ФМСФ, 1 мМ аскорбиновой кислоты и 1% поливинилпирролидона. Гомогенат центрифугировали (5 мин, 12000 g); полученный супернатант использовали для анализа. Реакционная смесь содержала К-фосфатный буфер (рН 7.0), 0.2 мМ аскорбиновой кислоты, 0.2 мМ ЭДТА и ферментативную вытяжку. Реакцию запускали добавлением 20 мкМ перекиси водорода. Измерения оптической плотности проводили при 290 нм в течение 120 с с интервалом в 1 с на спектрофотометре Lambda 25. За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, изменяющее оптическую плотность реакционной смеси на 0.001 ед. оптической плотности за единицу времени.
Определение жизнеспособности клеток проводили при помощи красителя голубого Эванса [16]. К 150 мг каллусной ткани (контроль, опыт) добавляли 500 мкл (0.025%) красителя и выдерживали при комнатной температуре 15 мин, после чего отмывали клетки дистиллированной во-
дой. К отмытым клеткам добавляли 1 мл 1% ДДС-Na в этаноле (500 мг ДДС растворяли в 50 мл 50% этанола). Раствор с клетками выдерживали 30 мин на водяной бане при 60оС. Далее его центрифугировали 5 мин при 12500 g. Оптическую плотность супернатанта измеряли при 600 нм. В качестве контроля (100% мертвых клеток) использовали 150 мг каллусной ткани, прокипяченной в течение 20 мин, или дважды замороженной жидким азотом и затем размороженной.
Экстракт фенольных соединений получали нагреванием измельченной лиофильно высушенной навески каллусной ткани (50 мг) в 1.5 мл 80% метанола на водяной бане (80°С) в течение 30 мин в закрытой пробирке. После о
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.