ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ, 2007, том 41, № 2, с. 161-165
УДК 66.011+663.15+579.66
ПОЛУЧЕНИЕ МОЛОЧНОЙ кислоты с помощью ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК ГРИБА ВЛШОРШ ОЯУгЛЕ ПРИ ОДНОВРЕМЕННОЙ ЭКСТРАКЦИИ ПРОДУКТА
© 2007 г. О. В. Спиричева, О. В. Сенько, Д. В. Веремеенко, Е. Н. Ефременко
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва efremenko@enzyme.chem.msu.ru Поступила в редакцию 19.07.2006 г.
Показана возможность получения в органической фазе за 25 ч до 15 г/л молочной кислоты с помощью иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток гриба Rhizopus oryzae при одновременной экстракции продукта в октан при использовании метилтриоктиламмоний хлорида в качестве переносчика лактат-ионов.
Молочная кислота и ее производные пользуются большим спросом на современном рынке. В ситуации постоянно возрастающего спроса особенно актуальными являются разработки и решения, касающиеся интенсификации процесса получения и выделения молочной кислоты.
В качестве новых перспективных продуцентов молочной кислоты привлекают внимание мице-лиальные грибы. В иммобилизованном виде они проявляют повышенную устойчивость к кислым значениям рН и высоким концентрациям молочной кислоты [1-3].
Процесс молочно-кислого брожения проводят в присутствии карбоната кальция CaCO3, позволяющего выводить молочную кислоту в виде лакта-та кальция из процесса и сдвигать равновесие системы в сторону образования целевого продукта. Для выделения молочной кислоты осадок лактата кальция обрабатывают серной кислотой, но при этом образуется гипс, являющийся крупнотоннажным отходом производства молочной кислоты.
В качестве альтернативного подхода к выведению молочной кислоты из процесса рассматривается экстракция кислоты из водной фазы в органическую непосредственно в ходе культивирования микроорганизмов [4, 5].
ЭКСТРАКЦИЯ МОЛОЧНОЙ кислоты
Одним из наиболее перспективных считается метод выделения молочной кислоты из водной фазы экстракцией органическим растворителем в присутствии переносчиков лактат-ионов - длин-ноцепочечных третичных аминов (А1атте-336, триоктиламин) или четвертичных заряженных (АН,иа1-336) [6]. Образуя комплекс с лактат-ионом, эти амины способствуют переносу лактата в органическую фазу. Схема этих процессов может быть представлена следующим образом:
^ъ-)^ + ОВД«,
^^ + №)аЧ
где L - лактат-ион.
Коэффициент распределения молочной кислоты между двумя фазами К определяется как соотношение концентраций молочной кислоты в органической С°щ и водной Са, фазах:
С
ТУ- _ °гё
К - —
^ая
Одна часть работ, касающихся выделения молочной кислоты с использованием экстракции, посвящена изучению закономерностей процесса экстракции при варьировании различных условий [7], а другая -обсуждению вопросов токсичности компонентов органической фазы по отношению к микроорганизмам, продуцирующим молочную кислоту [8].
При проведении исследований с участием микроорганизмов основное внимание направлено на получение максимального количества целевого продукта - молочной кислоты. При этом процессы ферментации и экстракции чаще всего разделены, что приводит к увеличению длительности всего процесса в целом и усложнению его технического оформления.
За счет оптимизации параметров продуктивности процессов - ферментации 0-е1т и экстракции Qextr - стремятся к максимизации общей продуктивности процесса Q по основному продукту Р:
Q = f(Qferm, = Р'Н — та1.
Концентрация биокатализатора Сса( напрямую влияет на продуктивность процесса ферментации, концентрация переносчика С(г - на выход молочной кислоты при проведении экстракции:
Q = Т°Сса1, Сг)
тах.
В данной работе исследовали процесс экстракции молочной кислоты непосредственно в процессе ее получения с помощью иммобилизованных кле-
ток гриба Rhizopus вгугав. В качестве органического растворителя был выбран октан, который как неполярный органический растворитель обладает наименьшей токсичностью по отношению к клеткам с гидрофильной поверхностью и является хорошим растворителем для третичных и четвертичных аминов - переносчиков лактат-ионов. В качестве переносчика лактат-ионов использовали четвертичный амин, метилтриоктиламмоний хлорид, аналог АНдиа1;-336, обладающий способностью хорошо связывать лактат-ион при значениях рН, оптимальных для жизнедеятельности клеток грибов (выше рКа молочной кислоты = 3.88).
При проведении исследований были поставлены следующие задачи:
показать возможность многократного использования системы иммобилизованные клетки-куль-туральная жидкость-органическая фаза для получения молочной кислоты;
провести оптимизацию функции продуктивности процесса за счет концентрации биокатализатора и переносчика лактат-ионов;
провести сравнительный анализ результатов процессов получения молочной кислоты с использованием общепринятого метода выделения продукта (при внесении в питательную среду карбоната кальция) и экстракции органическим растворителем.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Формирование биокатализатора. В работе использовали клетки гриба Rhizopus вгугав 1ЧККЬ-395. Иммобилизацию спор в криогель поливинилового
спирта и формирование биокатализатора проводили согласно запатентованному способу [9].
Условия ферментации и экстракции. Для получения молочной кислоты использовали жидкую питательную среду следующего состава (г/л): глюкоза - 100, (NH4)2SO4 - 3.02, MgSO4 ■ 7H2O -0.25, ZnSO4 ■ 7H2O - 0.04, K2HPO4 ■ 3H2O - 3. Эксперименты проводили в реакторе "Биостат" фирмы "B.Braun Melsungen AG" (Германия) объемом 1 л, содержащем 100 мл питательной среды и 100 мл органической фазы следующего состава: триоктилметиламмоний хлорид, октан различных концентраций, Твин-80 - 5 г/л. Условия проведения экспериментов следующие: частота вращения мешалки - 210 об/мин, температура - 30°C, длительность каждого цикла - 25 ч.
Для проведения сравнительного анализа в ряде экспериментов вместо органической фазы в реактор вносили карбонат кальция концентраций от 10 до 40 г/л, поддерживая рН среды 5.5.
Аналитические методы. Для определения концентрации глюкозы в среде использовали глю-козидазный метод с применением реагента фирмы "Импакт" (Россия). Концентрацию Х(+)-молочной кислоты определяли ферментативным лактаток-сидазно-пероксидазным методом с применением реагента фирмы "Sentinel" (Италия). За уровнем жизнеспособности иммобилизованных клеток следили по концентрации внутриклеточного АТФ, которую определяли, используя реагент иммолюм фирмы "Люмтек" (Россия).
При обработке всех экспериментальных данных рассчитывали среднее значение и стандартное отклонение. Все эксперименты проводили не менее трех раз.
K 2.5
C, г/л 25
20Р
15
10
5
0 100 200 300 400
концентрация ТОМАХ, г/л
Рис. 1. Влияние концентрации переносчика лак-татионов на экстракцию молочной кислоты в органическую фазу: 1 - общая концентрация молочной кислоты, 2 - коэффициент распределения К, 3 - концентрация молочной кислоты в органической фазе Corg, 4 - концентрация молочной кислоты в водной фазе Caq.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Влияние концентрации переносчика на коэффициент распределения молочной кислоты между водной и органической фазой в процессе ее получения. Для проведения экспериментов биокатализатор концентрацией 65 г/л помещали в 100 мл питательной среды, содержащей глюкозу, затем в реакционную систему вносили 100 мл органической фазы, содержащей триоктилметил-аммоний хлорид в пределах от 0 до 400 г/л.
Контроль водной фазы позволил установить, что значение рН среды во время процесса было постоянным и колебалось в интервале 5.5-5.8 и, следовательно, не оказывало негативного влияния на метаболическую активность клеток. При эксплуатации биокатализтора удельная концентрация внутриклеточного АТФ оставалась на постоянном уровне - (5-6) х 10-7 моль/г сухой иммобилизованной биомассы.
Из полученных данных (рис. 1) следует, что продуктивность процесса ферментации практически не менялась в диапазоне концентраций триоктилметиламмоний хлорида (ТОМАХ) от 0 до
400 г/л (Qferm = const = 0.8 ± 0.04 г/л ч), т.е. независимо от концентрации переносчика при использовании биокатализатора в присутствии органической фазы за 25 ч суммарно может быть получено 20-22 г/л молочной кислоты. Повышение исходной концентрации переносчика ТОМАХ с 0 до 200 г/л сопровождалось четырех кратным увеличением коэффициента распределения (с 0.3 до 1.2), и в результате 23-58% образующегося продукта переходило в органическую фазу.
Q = XQferm, Qextr) = AQr = 200 г/л) -► таХ.
Таким образом, в данных условиях наиболее целесообразным оказалось использование переносчика лактат-ионов концентрации 200 г/л, при которой обеспечивается 55%-й переход образующегося лактата в органическую фазу. При этом общая продуктивность процесса составила 0.46 ± 0.04 г/л ч, это в пять раз ниже аналогичного процесса с использованием карбоната кальция.
Влияние концентрации биокатализатора на характеристики процесса получения молочной кислоты при одновременной экстракции продукта в органическую фазу. Был исследован процесс получения молочной кислоты при варьировании исходной концентрации биокатализатора от 40 до 330 г/л в условиях одновременной экстракции про-
дукта в органическую фазу, содержащую 200 г/л ТОМАХ (рис. 2).
Было установлено, что биокатализатор может быть использован для получения молочной кислоты в периодическом процессе при разных исходных концентрациях без потери им активности в течение, как минимум, 100 ч. При этом за 25 ч может быть получено до 30 г/л конечного продукта с коэффициентом распределения между водной и органической фазой 1.2.
Максимальные выходы молочной кислоты были получены при наибольших концентрациях биокатализатора в среде - 230-330 г/л, при этом была отмечена максимальная продуктивность процесса синтеза молочной кислоты - 1 ± 0.03 г/л ч. Однако максимальная удельная продуктивность иммобилизованных клеток и высокие концентрации молочной кислоты в органической фазе после экстракции были отмечены при 65 и 90 г/л биокатализатора в среде (табл). Известно, что высокие концентрации биокатализатора приводят к снижению его удельной продуктивности за счет лими
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.