ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2008, том 419, № 3, с. 406-409
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 575.116.4
ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТНЫХ МЫШЕИ С НАРУШЕНИЯМИ, НАПРАВЛЕННО ВНЕСЕННЫМИ В СТРУКТУРУ ГЕНОМНЫХ ЛОКУСОВ ДВУХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА ГЕНОВ d4: neuro-d4 И eer-d4 © 2008 г. И. Б. Мерцалов, Н. Н. Иинкина, Ю. Ш. Ванлесс, В. Л. Бухман,
член-корреспондент РАН Л. И. Корочкин , Д. А. Куликова
Поступило 03.08.2007 г.
С целью выяснения функционального значения генов семейства d4 и их роли в индивидуальном развитии организма млекопитающих мы провели эксперименты по направленной инактивации трех генов семейства у мыши: пвитв-йА, ubi-d4/Requiem и cer-d4. Ранее нами была охарактеризована структурная организация всех трех генов семейства d4 мыши, изучена их временная и ткане-специфическая экспрессия и клонированы фрагменты ДНК, перекрывающие три исследуемых локуса [1, 2]. Наличие информации о структуре и экспрессии генов позволило разработать оптимальную стратегию их направленной инактивации. На данный момент удалось получить мутант-ные линии мышей с нарушенными локусами двух генов семейства: neuro-d4 и сег^4. Ярко выраженных фенотипических проявлений мутаций не было обнаружено. В дальнейшем мы намерены изучить фенотипы полученных мутантных линий мышей более детально.
Три родственных гена: neuro-d4, ubi-d4/Requi-ет и cer-d4 образуют семейство генов d4 в геномах позвоночных животных [1-6]. Белки, кодируемые генами этого семейства, имеют общий план строения и высокую гомологию аминокислотных последовательностей структурных доменов. Все белки семейства имеют в Й-концевой области уникальный домен 2/3, который содержит сигнал ядерной локализации и, вероятно, необходим для проникновения белков в ядро клетки. В центральной части белковой молекулы расположен домен, гомологичный известным ДНК-связывающим последовательностям цинковых пальцев Крюппель-
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской Академии наук, Москва Институт биологии гена Российской Академии наук, Москва School of Biosciences Cardiff University, United Kingdom
типа, и последовательность отрицательно заряженных аминокислот (предполагаемый активатор транскрипции). В С-концевой области находится еще один домен, характерный для белков семейства d4 ^4-домен), структура которого представляет собой расположенные друг за другом два цинковые пальца РИБ-типа (рис. 1А, Б). Эволюционный консерватизм является характерным свойством генов семейства d4. Они обнаружены у человека, крысы, мыши, цыпленка [1, 2, 5, 6], Хепорш 1аеу18 [7], а также в геномах Сае-погИаЬёШз е1е§аш [8] и БгозорИПа ше1апо§аз1ег [9] и отсутствуют только у прокариот и низших эука-риот (дрожжей) [6]. Количество генов семейства в геноме варьирует от единственного представителя у С. е1е§аш, двух генов у Б. ше1апо§аз1ег, до трех в геномах позвоночных. Особый интерес вызывает тот факт, что кроме увеличения копийно-сти в геноме, усложняется также и регуляция экспрессии генов в эволюционном ряду: возникают альтернативные первые экзоны с соответствующими промоторными районами, а также усложняется процесс альтернативного сплайсинга. Наиболее сложную геномную организацию и регуляцию экспрессии генов семейства имеют позвоночные животные [1-4, 5]. Все три гена семейства d4 экспрессируются в центральной и периферической нервной системе позвоночных, но если для neuro-d4 и cer-d4 характерен нейроспецифи-ческий характер экспрессии, то ubi-d4/Requiem одинаково сильно экспрессируется и во всех других исследованных тканях и органах. В процессе индивидуального развития животных экспрессия генов neuro-d4 и cer-d4 дифференциально регулируется в различных отделах развивающейся нервной системы. Анализ структуры и динамики внутриклеточной локализации белков, кодируемых генами семейства d4, позволил предположить, что они могут являться факторами, регулирующими транскрипцию. Функциональное значение этих белков для нервной системы и организма в целом до сих пор остается не выясненным. Предполагается, что
белки neuro-d4 и cer-d4 участвуют в регуляции транскрипции кластеров нейроспецифических генов посредством изменения конденсированного-деконденсированного состояния хроматина в ядре [10]. С целью выяснения функционального значения генов семейства d4 и их роли в индивидуальном развитии организма млекопитающих мы провели эксперименты по инактивированию всех трех d4 генов мыши. На данный момент удалось получить мутантные линии мышей с нарушенными локусами двух генов семейства: neuro-d4 и cer-d4.
Разработка конструкции для направленного нарушения структуры локуса гена neuro-d4. Ранее нами был клонирован фрагмент ДНК, содержащий всю последовательность гена neuro-d4 мыши, была установлена его полная нуклеотидная последовательность и показано, что ген состоит из двенадцати экзонов. Мы локализовали ген neuro-d4 на 7-й хромосоме мыши в области 7В1 [2]. Нами было также показано, что существует сложная система регуляции экспрессии этого гена, и выявлено множество транскриптов, образующихся в результате дифференциального сплайсинга и использования альтернативных промоторов. Однако тот факт, что вся структура данного гена представлена в последовательности ДНК сравнительно небольшого фрагмента протяженностью около 10 т.п.н. (kb), сделал его удобным для проведения нокаутного эксперимента с делетированием основной части кодирующей последовательности. Ожидаемым результатом было нарушение структуры всех вариантов транскриптов гена, что должно привести к полной потере его функции.
Плазмидная конструкция для инактивирова-ния neuro-d4 гена мыши была выполнена на основе вектора pPNT. Этот вектор содержит 2 селективных маркера: ген тимидинкиназы (ТК) и ген устойчивости к неомицину (NEO), регулируемые PGK промоторами, и также две области справа и слева от пео-маркера, в которые осуществляется клонирование короткого и длинного плеча нока-утной конструкции (рис. 1А). Короткое и длинное плечи конструкции содержали последовательности II и III экзонов и фрагмент XII экзона соответственно. В результате гомологической рекомбинации данной конструкции и геномной ДНК из локуса neuro-d4 делетируется последовательность, перекрывающая восемь из двенадцати экзонов гена (экзоны IV-XI). Последовательности этих экзонов входят во все возможные варианты транскриптов гена и содержат информацию о всех доменах белка, за исключением домена 2/3. Мы предполагаем, что в результате такой деле-ции происходит полная потеря функции гена, так как из генома удаляется около 80% его кодирующей последовательности.
Разработка конструкции для направленного нарушения структуры локуса гена евт-й4. Предварительная работа по анализу структуры мРНК гена евт-йА мыши показала, что существует множество вариантов транскриптов этого гена. Ген евт-йА нами был локализован на 12-й хромосоме мыши в области 12Б3 [1]. Кроме того, мы показали, что локус этого гена имеет протяженность около 250 т.п.н. Ген евт-й4 состоит из 12 экзонов. Полноразмерный вариант мРНК, образующийся после сплайсинга первичного транскрипта, кодирует белок, содержащий основные домены белков семейства, включая характерный С-концевой домен ё4. Однако ген евт-й4 имеет в структуре альтернативный экзон Х2, который расположен между 8-м и 9-м экзонами. При альтернативном сплайсинге, включающем первые восемь экзонов и экзон Х2, образуется мРНК, кодирующая белок без домена ё4, но с альтернативной С-концевой последовательностью, так называемым доменом Х2. Нами были клонированы фрагменты геномной ДНК, содержащие кодирующие последовательности экзонов VIII и Х2, которые представлены во всех возможных сплайс-вариантах мРНК данного гена (Рис. 1Б).
Плазмидная конструкция для инактивирова-ния гена евт-й4 мыши была выполнена на основе вектора рРКТ. Короткое и длинное плечи конструкции содержали некодирующие последовательности справа и слева от расположенных близко друг к другу экзонов VIII и Х2. При гомологической рекомбинации данной конструкции и геномной ДНК из локуса гена евт-й4 делетируется фрагмент, содержащий последовательность этих двух экзонов (рис. 1Б). Предварительный анализ последствий удаления из генома этого фрагмента указывает на то, что кодирующая последовательность всех вариантов мРНК мутант-ного гена будет иметь нарушенную рамку считывания и это должно будет повлиять на первичную структуру кодируемого белка так, что функция его, вероятно, будет полностью блокирована.
Получение мутантных мышей с нарушенной структурой генов семейства й4: пвито-й4 и евт-й4. Нокаутные плаз-мидные конструкции пвито-й4 и евт-й4, выполненные на основе плазмидного вектора рРКТ, переводили в линейную форму с помощью рестрикционной эн-донуклеазы N0^ и использовали для электропора-ции эмбриональных стволовых клеток (ББ-клеток) мыши линии 129 01а/№ё (золотисто-коричневая окраска шерсти-агути). Далее клетки подвергали селекции на селективной среде, содержащей гени-тицин (¿418) и ганцикловир (¿А^). ДНК ББ-кло-нов, устойчивых к селективным агентам, анализировали с помощью гибридизации по Саузерну. Сау-зерн-блот анализ отобранных клонов показал, что мы получили три клона ББ-клеток с правильно
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 419 < 3 2008
408
Ген neuro-d4
ù^omi: 1G 1 kb
мРЖ
МЕРЦАЛОВ и др.
(A)
1 1' 2 3 ц 5 б 7 8 9 1G 11112
fMMt
Бeлoк
N-- 2/3
d4 --C 38G-388 a.к.
N--2/3
d4
C 332 a.к.
RV 1 1' 2 3 45 б 7 8 9 1G11 12
II II II lip
II II л
-I PüC ~|< TK "ji
RV
2 3^ . 12
H^l neo p
I
I I
I I
RV 11' 2 3 lRV 12
- L-H-H—tW»
RV 1 2
___I
1 kb
RV
J-,---L
22 kb
4 kb
Ген cer-d4
(Б)
Экзoны: 1
мPHK
r~-HWYYft"
2 3 45 б 7 1 8 XZ
Бeлoк
N-- 2/3
9 1G 11
1G kb
I____1
i
XZ
C 35б a.к.
d4
C 378 a.^
B
Ex 8 XZ -i—■
NEO
B
Д/
7—Г
/V/
B
_ 1 _
1 kb
TK PüC
B
I I I
B
-! NEO I-L
B
_ 1 _
1 2
-21 kb -7.8 kb
a
ДOKЛAДЫ AKAДEMИИ HAyK тoм 419 № 3 2GG8
Рис. 1. Направленный мутагенез локусов генов neuro-d4 (А) и cer-d4 (Б) мыши. В верхней части схем (А) и (Б) изображены основные сплайс-варианты мРНК генов neuro-d4 и cer-d4 мыши и соответствующие им белки. 2/3, d4 и XZ - домены белков, черным цветом в структуре белка обозначен до
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.