научная статья по теме ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТНЫХ ШТАММОВ YARROWIA LIPOLYTICA – ПРОДУЦЕНТОВ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ИЗ ГЛЮКОЗЫ Химия

Текст научной статьи на тему «ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТНЫХ ШТАММОВ YARROWIA LIPOLYTICA – ПРОДУЦЕНТОВ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ИЗ ГЛЮКОЗЫ»

ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2008, том 44, № 2, с. 219-224

УДК 576.809.558

ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТНЫХ ШТАММОВ Yarrowia lipolytica -ПРОДУЦЕНТОВ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ИЗ ГЛЮКОЗЫ

© 2008 г. Т. В. Финогенова, И. Ф. Пунтус, С. В. Камзолова, Ю. Н. Лунина, С. Е. Монастырская, И. Г. Моргунов, А. М. Воронин

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина, Пущино, Московская обл., 142290

e-mail: morgunovs@rambler.ru Поступила в редакцию 14.09.2006 г.

Исследовали возможность получения с помощью УФ-облучения и М-метил-М'-нитро-М-нитрозогу-анидина мутантов дрожжей Yarrowia lipolytica ВКМ Y-2373, обладающих повышенной способностью к синтезу лимонной кислоты из глюкозы. При обработке Y. lipolytica УФ и N-метил-М'-нитро-N-нитрозогуанидином из 1500 колоний было отобрано 3 мутанта, характеризующихся более высокой (на 23.0%), чем исходный штамм, биосинтетической активностью. При комбинированном воздействии УФ и М-метил-№-нитро-М-нитрозогуанидина на клетки Y. lipolytica из 1000 колоний отобраны еще 3 мутанта, у которых биосинтетическая активность на 43.9% выше, чем у исходного штамма. Для быстрого отбора мутантов разработаны селективные среды с цитратом и ацетатом, а также экспресс-методы для выявления активных продуцентов лимонной кислоты на твердых средах с мелом и бромкрезолом, включавшие лимитирующую концентрацию аминного азота и избыток глюкозы.

Лимонная кислота (ЛК) производится микробиологическим способом во всех промышленно развитых странах. Ежегодно в мире производится более 800000 т ЛК, а годовой прирост производства составляет 5% от существующего уровня [1].

При традиционном способе получения ЛК в качестве продуцента используют мицелиальные грибы Aspergillus niger, основным сырьем является свекловичная (реже тростниковая) меласса - отход производства сахара. Содержание сахара в мелассе не превышает 50%, остальные 50% - это балластные вещества, которые не используются продуцентом и выбрасываются в окружающую среду. Кроме того, предусматривается обязательная обработка мелассы ферроцианидами для удаления избыточного содержания микроэлементов [2]. Таким образом, традиционный процесс производства ЛК из мелассы является сложным и экологически небезопасным.

В настоящее время в качестве доступного и дешевого сырья для микробиологического синтеза рассматривается глюкоза, производящаяся путем энзиматического гидролиза крахмала. В связи с этим обсуждается вопрос о перспективе производства ЛК с помощью A. niger из чистых сахаров - сахарозы или глюкозы.

Долгое время считалось, что только мицелиальные грибы способны продуцировать ЛК. Велась постоянная работа по получению и селекции мутантов A. niger - продуцентов ЛК [2]. В 60-е годы прошлого века было показано, что алканутилизирующие дрожжи также способны продуцировать ЛК и дру-

гие кислоты [3]. Наиболее активными продуцентами ЛК оказались дрожжи вида Candida (Yarrowia) lipolytica [4, 5]. Условием синтеза ЛК дрожжами является лимитирование их роста минеральными компонентами среды (N, P, S или Mg) при избыточном содержании источника углерода [6]. При использовании в качестве источника углерода н-алка-нов и этанола дрожжи Y. lipolytica продуцируют одновременно две кислоты - ЛК и изолимонную кислоту (ИЛК) в примерно равных количествах, а на глюкозе синтезируют практически одну ЛК [7]. Однако следует отметить, что при росте на глюкозе штаммы Y. lipolytica синтезируют меньшее количество ЛК, чем на других субстратах [7]. В ходе предварительных исследований изменением условий культивирования и состава среды не удалось достичь высокой концентрации ЛК из глюкозы у исследованных штаммов.

Цель работы - получение с помощью ультрафиолетового облучения (УФ) и обработки мутагеном М-метил-К-нитро-М-нитрозогуанидином (НГ) му-тантных штаммов Y. lipolytica, обладающих повышенной способностью к синтезу ЛК из глюкозы.

МЕТОДИКА

Объекты. Использовали природный штамм Y. И-polytica ВКМ У-2373, способный синтезировать ЛК из н-алканов, глюкозы и других субстратов [8]. Штамм поддерживали на агаризованной среде Ри-дер с глюкозой при 4°С.

Количество клеток

1.00Е+08 -

(а)

1.00Е+06 -

1.00Е+04

0 1 2 3 4 5 6 7

мин

1.00Е+09

1.00Е+07

1.00Е+05

(б)

1 1 1 1 1 .....

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

мкг/мл

Рис. 1. Кривые выживаемости штамма У. Иро1уйса ВКМ Y-2373 при УФ-облучении (а) и после обработки НГ (б). Стрелкой указана доза облучения и концентрация НГ, при которой выживаемость составляет 0.1-1% в случае УФ и 25% в случае НГ.

Обработка клеток УФ и НГ. В качестве мутагенных агентов использовали УФ-лучи, источником которых служила бактерицидная лампа (с расстояния 10 см; аппарат ВИО-2, Россия, "Фимет"; длина волны 200-400 нм) и НГ в диапазоне концентраций от 0 до 100 мкг/мл.

Для получения мутантов исходную культуру выращивали на жидкой среде Ридер следующего состава (г/л): ^Н4)^04 - 3.0, МgSO4 - 0.7, Ca(NO3)2 -0.4, №а - 0.5, КН2Р04 - 1.0, К2НР04 - 0.1, раствор микроэлементов по Буркгольдеру [9], дрожжевой экстракт "Б1&о" - 0.5, глюкоза - 20.0. Клетки, находящиеся в фазе активного роста (биомасса 3-4 г/л), отделяли от культуральной жидкости центрифугированием (5000 g, 15 мин), дважды промывали 0.1 М раствором MgSO4 и суспендировали в 0.1 М MgSO4. Суспензию клеток обрабатывали УФ или НГ. В качестве контроля использовали необработанную суспензию.

Из обработанных и контрольной суспензий готовили ряд стандартных разведений и высевали на чашки Петри с агаризованной средой, состоящей из среды Ридер и бакто-агара (20.0 г/л). Разведения суспензий при этом подбирали так, чтобы на каждой чашке вырастало до 100 колоний. Чашки инкубировали в термостате при 28°С в течение 48 ч. После этого подсчитывали количество выживших колоний, строили график выживаемости клеток в

зависимости от времени облучения УФ и концентрации НГ (рис. 1). Согласно общепринятым методикам [10], анализировали те чашки, где процент выживаемости подвергнутых мутагенному воздействию клеток составлял менее 1% в случае УФ, т.е. диапазон облучения от 3 до 7 мин и - менее 25% в случае НГ, т.е. при концентрации 30-80 мкг/мл. Среди анализируемых колоний отбирали колонии, отличающиеся более мелкими размерами. Затем наиболее активные кислотообразующие штаммы, облученные УФ, повторно обрабатывали НГ, а штаммы после обработки облучали УФ. Для повторной обработки УФ-штаммов использовали дозу индукции НГ - 50 мкг/мл, время экспозиции 3-6 мин.

Селекция мутантов на твердых средах с ацетатом и цитратом. Колонии, полученные в результате обработки исходного штамма мутагенами УФ и НГ, переносили с помощью репликатора на чашки с агаризованной средой Ридер, содержащей ацетат (45.0 г/л) или цитрат натрия (37.2 г/л) вместо глюкозы в качестве источника углерода. Культуру выращивали 3-4 сут при 28°С. Варианты, характеризующиеся замедленным ростом на этих субстратах, далее оценивали на кислотообразующую активность на твердых средах и при культивировании в колбах.

Оценка кислотообразования на твердых средах.

Кислотообразование дрожжей оценивали в условиях лимитирования роста клеток азотом по зонам растворения мела или с индикатором бромкрезо-лом зеленым в чашках Петри с агаризованной средой следующего состава (г/л): глюкоза - 20.0, МgSO4 - 0.7, Са^03)2 - 0.4, №С1 - 0.5 г, КН2Р04 -1.0, К2НР04 - 0.1, дрожжевой автолизат - 8.0 мл/л (содержание азота - 60 мг/л), раствор микроэлементов по Буркгольдеру [9], бакто-агар - 20.0. В одну часть чашек вносили мел (СаС03 - 6.0 г/л), который добавляли в разогретую среду непосредственно перед разливом в чашки Петри. В другую часть чашек вносили бромкрезол зеленый (8 мл 0.4%-ного спиртового раствора индикатора на 100 мл среды). После полного остывания среды репликатором наносили клетки исследуемых культур. Инкубацию проводили в течение 3-7 сут при 28°С.

Оценка кислотообразования дрожжей в жидких средах. Кислотообразование в жидкой среде оценивали через 6 сут культивирования исследуемых мутантов в колбах (50 мл среды в колбе объемом 750 мл) при 28°С в условиях дефицита источника азота на среде следующего состава (г/л): ^Н4)^04 -0.3, МgSO4 - 0.7, Са(Ш3)2 - 0.4, №С1 - 0.5 г, КН2Р04 - 1.0, К2НР04 - 0.1, раствор микроэлементов по Буркгольдеру [9], дрожжевой экстракт "Ш"-со" - 0.5, глюкоза - 30.0. По мере потребления глюкозу (10 г/л) вносили дополнительно; рН среды 5.06.0 поддерживали 10%-ным раствором №ОН.

Определение биомассы и содержания метаболитов в культуральной жидкости. Определение биомассы дрожжевых клеток в культуральной жидкости проводили фильтрованием определенного объема ее через мембранные фильтры с последующей оценкой веса сухой дрожжевой биомассы. Содержание глюкозы в среде определяли по реакции ферментативного окисления, катализируемой глю-козооксидазой с использованием наборов реактивов фирмы "Диакон" (Россия). Для определения содержания ЛК и ИЛК использовали метод ВЭЖХ. Элюцию вели при следующих условиях: скорость потока 1 мл/мин; температура 35°С, в качестве подвижной фазы использовали 20 мМ фосфорную кислоту. Для разделения ЛК и ИЛК применяли колонку с обращенной фазой Inertsil ODS-3 (250 х 4 мм) ("Элсика", Россия). В работе использовали хроматограф фирмы "LBK" (Швеция). Органические кислоты определяли при 210 нм и идентифицировали в соответствии со стандартным раствором ЛК ("Boeh-ringer Manheim", Германия) и ИЛК ("Sigma", США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение мутантов с применением УФ и НГ.

На рис. 1 представлены кривые выживаемости дрожжей в зависимости от дозы облучения УФ и обработки НГ. Кривые выживаемости клеток дрожжей исходной культуры в зависимости от дозы УФ и концентрации НГ имели сложный характер: начальный участок имел экспоненциальную зависимость, затем следовало плато, указывающее на то, что облучаемые суспензии содержали клетки, устойчивые к мутагенам. Подобные кривые были получены ранее для этого штамма [8] и указывали на гаплоидность исходного штамма.

Полученные 500 колоний в случае обработки УФ и 1000 колоний - НГ использовали для отбора на агаризованных средах с цитратом или ацетатом. Отбирали колонии, характеризующиеся замедленным ростом на среде с ацетатом и

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»