ГЕНЕТИКА, 2010, том 46, № 1, с. 14-17
ОБЩАЯ ГЕНЕТИКА
УДК 576.6:581.557
ПОЛУЧЕНИЕ НОВОЙ ПЕРЕСЕВАЕМОЙ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ Drosophila melanogaster ИЗ ЛИНИИ МУХ, ИНФИЦИРОВАННЫХ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ЭНДОСИМБИОТИЧЕСКОЙ БАКТЕРИЕЙ
Wolbachia pipientis В ПРИРОДЕ
© 2010 г. Б. В. Андрианов, И. И. Горячева, И. Д. Александров, Т. В. Горелова
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, Москва 119991;
e-mail: andrianovb@mail.ru Поступила в редакцию 24.12.2008 г.
Wolbachia pipientis — облигатно-внутриклеточная бактерия, инфицирующая ряд видов членистоногих и филярий. На уровне организма инфекция Wolbachia может вызывать партеногенез, феминизацию генетических самцов, бессамцовость, цитоплазматическую несовместимость или проходить бессимптомно. Дополнительный интерес исследованиям придает недавнее открытие возможности переноса ДНК бактерии в геном насекомого-хозяина. На клеточном уровне эффекты, вызываемые Wolbachia, менее изучены. Среди большого числа известных клеточных линий насекомых лишь одна получена от инфицированного Wolbachia вида комара Aedes albopictus. В данной работе описано получение пересеваемой клеточной линии Dm2008Wb1 из эмбрионов инфицированных в природе Drosophila melanogaster. Wolbachia сохраняется как в первичной клеточной культуре, так и в процессе ее трансформации в пересеваемую. Наличие бактерии в клетках в свободной форме подтверждено возможностью излечения клеток от Wolbachia обработкой тетрациклином, а также успешной передачей Wolbachia в другую клеточную линию S2, в которой она ранее не была выявлена.
Жо1ЬасШа является самым распространенным внутриклеточным бактериальным симбионтом членистоногих. Она детерминирует четыре типа нарушения полового размножения хозяев — цитоплазматическую несовместимость, феминизацию, партеногенез и андроцид (бессамцовость) [1, 2]. Изучение симбиотической бактерии Жо1Ьа-сЫа может быть использовано для разработки генетических методов контроля численности насекомых — переносчиков заболеваний человека и животных, а также вредителей сельскохозяйственных культур. Разработка биологического метода контроля особенно актуальна в связи с широким распространением популяций насекомых, резистентных к применяемым инсектицидам.
Естественным механизмом нарушения репродукции, который потенциально может быть использован для целей контроля численности популяций насекомых, можно считать цитоплазмати-ческую несовместимость, детерминируемую цитоплазматической симбиотической бактерией рода Жо1Ьаек1а [1], приводящую к появлению полностью или частично стерильного потомства.
Недавно были обнаружены случаи встраивания ДНК МЫЬаеМа в геном насекомого-хозяина. Существование такого переноса между геномами МЫЬаеМа и насекомого-хозяина потенциально связывает геномы всех насекомых и может существенно изменить представления об эволюции
этой систематической группы. Еще в 1993 г. было показано, что эта бактерия, вызывающая феминизацию у ракообразных, может существовать у хозяина в двух формах — как бактериальный симбионт, для которого характерно цитоплазматиче-ское наследование, и как "менделевский" признак с типичным ядерным наследованием [3]. Се-квенирование генома МЫЬаеМа [4] и последовавший за этим анализ выявили в ядерном геноме насекомых фрагменты бактериального генома [5, 6]. Геном Б. ananassae содержит практически полный геном МЫЬаеМа, хотя и с большим числом псевдогенов [7].
Особенностью жизненного цикла МЫЬаеМа является ее облигатное внутриклеточное существование. Это затрудняет культивирование бактерии и требует разработки специальных методов, которые позволят проводить исследование генетики микроорганизма. Одним из таких методов может быть изучение Жо1Ьаск1а в клеточной линии. Первая клеточная линия насекомых, содержащая Жо1Ьаек1а, получена у комара А. а1Ъор1с-Шз [8]. В этой линии Жо1ЬасМа стабильно поддерживается и может быть выделена в чистом виде из механически разрушенных клеток. Бактерия сохраняет инфекционность для клеточных культур дрозофил, комаров и бабочек [9]. Проанализированные нами распространенные клеточные культуры дрозофилы 82, 83, Кс, 67]25Э не содержат Жо1Ьаск1а, что может быть вызвано как случайно-
ПОЛУЧЕНИЕ НОВОЙ ПЕРЕСЕВАЕМОЙ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ
15
стью, так и гибелью бактерии в процессе жесткой процедуры стерилизации эмбрионов, использованной при получении этих линий.
Для решения этого вопроса мы получили новую клеточную линию D. melanogaster с применением более мягкой методики обработки эмбрионов. Полученная линия содержала жизнеспособные бактерии Wolbachia, способные инфицировать другую клеточную линию мух и удаляемые обработкой тетрациклином.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Линии мух. В работе использованы линии мух Drosophila melanogaster. инфицированная Wolbachia в природе линия дикого типа Черноморка и лабораторная линия F32. Самок линии Черноморка скрещивали с самцами линии F32 и из эмбрионов F1 получали клеточную линию.
Получение клеточной линии. Культуру получали по модифицированному протоколу [10]. Взрослых мух помещали в пробирки со свежим кормом и удаляли сразу после откладки яиц. Затем пробирки с отложенными яйцами заливали щелочным раствором 2.5%-ного гипохлорита натрия. Дехорионизированные эмбрионы всплывают на поверхность и остаются на поверхностной пленке, практически не контактируя с раствором. В стерильных условиях ламинарного бокса плавающие эмбрионы собирали и переносили иглой на поверхностную пленку аптечного препарата "иодинол". Собрав эмбрионы в пробирку с иоди-нолом, добавляли три объема 70%-ного этанола. Эмбрионы осаждали при 800 g 1 мин, затем промывали в том же режиме средой C46 с добавлением 20%-ной инактивированной сыворотки. Далее эмбрионы механически гомогенизировали и суспендировали в той же среде до концентрации примерно 2 х 106 кл/мл, после чего клеточную суспензию высевали в чашку Петри и культивировали при 26°С.
Рост первичной культуры отмечался через 2 сут, а трансформация в пересеваемую — через 2—6 месяцев.
ПЦР-идентификация Wolbachia. ДНК выделяли из имаго и из клеток пересеваемой культуры методом фенол-хлороформной экстракции [11]. ПЦР-амплификацию проводили на матрице тотальной ДНК, выделенной из одной мухи или из 106 клеток культуры. ПЦР проводили с праймера-ми wsp81F: 5' - GTCCAATAAGTGATGAA-GAAAC-3' и wsp691R: 5'-AAAAATTAAACGC-TACTCCA-3', специфичными к участку гена wsp Wolbachia [12], на амплификаторе Applied Biosystems в следующих условиях: первичная денатурация — 5 мин при 94° С; 35 циклов: денатурация при 94°С — 15 с, отжиг при 55°С — 15 с, синтез при 72°С — 40 с; завершающий синтез при 72°С —
4 мин. Продукты амплификации разделяли методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле.
В результате ПЦР с праймерами, специфичными к гену wsp, был получен фрагмент специфического размера около 570 пн, характерный для Wolbachia.
Для контроля сохранности матрицы во всех опытах дополнительно проводили ПЦР-ампли-фикацию с праймерами на консервативный в роде Drosophila фрагмент митохондриального гена 168 РНК: прямой: 5'-TAAAGATTTAT-AGGGTCTTCTCGTC-3'; обратный: 5'-TAAC-CTGCCCACTGAAAATT-3'.
Инфицирование клеточной линии дрозофилы бактерией Wolbachia. Полученную клеточную культуру Dm2008Wb1 выращивали до плотности 4 х 106 кл/мл, снимали с поверхности культураль-ной чашки энергичным пипетированием, бактерии отделяли от клеток фильтрованием через бумажный фильтр. В первых экспериментах клетки предварительно разрушали встряхиванием со стеклянными шариками, но впоследствии оказалось, что Wolbachia присутствует и в среде интакт-ной культуры, что позволило опустить этот этап выделения. Отсутствие клеток дрозофилы в фильтрованной среде контролировали микроскопически.
Для заражения выделенными бактериями культуры 82 [13], в которой Wolbachia не обнаружена, клетки отделяли от среды центрифугированием и переносили в фильтрованную среду с Wol-bachia в центрифужную пробирку. Заражение осуществляли по методу [9], центрифугируя клетки дрозофилы и Wolbachia при 2500 §, 15°С 1 час. После центрифугирования клетки суспендировали в среде С46 с 10% инактивированной сыворотки до концентрации 2 х 106 кл/мл и переносили в чашку Петри для пассирования.
Тест на Wolbachia осуществляли через два последовательных пассажа с разведением 1 : 5. В качестве контроля использовали заражение клеток инактивированными бактериями, для чего среду с Wolbachia до опыта выдерживали при 56°С в течение 30 мин.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Последовательность событий, приводящая к получению пересеваемой культуры из эмбрионов, инфицированных Wolbachia, не имела существенных отличий от традиционной для дрозофилы. В первые несколько дней после получения клеточной суспензии клетки эмбрионов продолжают активно делиться и дифференцироваться в различных направлениях с образованием нервно-мышечных конгломератов, находящихся в постоянном ритмическом сокращении. На 7-10-е сут после начала культивирования наблюдался апо-птоз, в ходе которого погибало более 90% клеток.
16
АНДРИАНОВ и др.
—о
Рис. 1. Морфология клеток пересеваемой культуры
Dm2008Wb1. Мелкие эпителиоподобные клетки образуют плотные колонии на поверхности чашки Петри.
На протяжении последующих нескольких месяцев клетки практически не делятся и большинство заложенных культур постепенно погибает.
Первые колонии делящихся клеток появились через 6 месяцев после начала культивирования. Этот момент можно считать началом трансформации первичной культуры в пересеваемую. Полученная культура была названа Dm2008Wb1, морфология ее клеток имела некоторые особенности (рис. 1). Клетки округлые, мелкие, с диаметром около 10 мкм, что вдвое меньше типичного диаметра клеток пересеваемых культур дрозофилы. Они образуют плотные, медленно растущие колонии, крепко прикрепленные к поверхности пластика. К настоящему моменту культура существует около года и в ней стабильно присутствует Wolbachia.
Полученную культуру использовали как источник для выделения Wolbachia. За основу был взят протокол выделения Wolbachia из клеток пересеваемой культуры [14]. Метод основан на механическом разрушении клеток стеклянными шарами с последующим отделе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.