БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 2, с. 280 - 284
УДК 578.245
ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА-А3 МЫШИ: ЭКСПРЕССИЯ В КЛЕТКАХ Escherichia coli В РАСТВОРИМОЙ ФОРМЕ И ОЧИСТКА В ОДНУ СТАДИЮ
© 2015 Я.Ку. Венг#, М. Жоу#, Л.М. Зенг#, Ку.Я. Гао, Кс.Л. Юан, Я. Ли*, М.С. Ли*
Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, Department of Immunology, Ningbo University School of Medicine, Ningbo 315211, China; fax: +(86)574-876009893, E-mail: yanli319@yahoo.com, limingcai@nbu.edu.cn
Поступила в редакцию 22.05.14 После доработки 26.08.14
Интерферон (IFN)-A3 — член семейства IFN типа III, является цитокином множественного действия и оказывает антипролиферативное, антивирусное и иммудомодулирующее действие. Для проведения функциональных исследований был разработан эффективный метод получения мышиного IFN-A3 в больших количествах, включающий клонирование и экспрессию гибридного гена интерферона IFN-A3, а также очистку рекомбинантного белка. С этой целью район кДНК, кодирующий зрелый белок IFN-A3, был клонирован в прокариотический вектор экспрессии pET-44 и впоследствии экспрессирован в клетках Escherichia coli. Продуцирующийся в растворимой форме гибридный рекомбинантный белок содержал на С-конце гисти-диновый гексапептид (His)6 и был очищен до гомогенного состояния методом металлаффинной хроматографии с использованием Ni2+-HTA (нитрилотриацетат)-агарозы. Установлено, что очищенный рекомбинантный IFN-A3 существенно подавляет продукцию интерлейкина IL-13 макрофагами RAW264.7, стимулированными липополисахаридом. Показано, что продукция большого количества растворимого белка IFN-A3 путем его экспрессии в клетках Escherichia coli с использованием вектора pET-44 является удачным способом получения нативного интерферона IFN-A3. Разработанный метод может быть использован для получения интерферонов других типов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: интерферон-А3, Escherichia coli, вектор экспрессии pET-44, рекомбинантный белок.
IFN-A, составляют новое семейство интерферонов, открытых под руководством Котенко [1] и Клучера [2] независимо друг от друга. Это семейство включает в себя три белка: IFN-A.1, IFN-A2 и IFN-A.3. Кодирующие их последовательности ДНК родственны генам интерлейки-нов семейства IL-10 [3—5], а поэтому эти белки были вначале описаны как IL-29 (IFN-A.1), IL-28A (IFN-A.2) и IL-28B (IFN-A.3) [2]. Однако впоследствии выяснилось, что по своей первичной структуре и функциям белки IFN-A, более напоминают интерфероны типа I, чем IL-10; они принимают участие в интерферон-активи-руемых сигнальных путях и индуцируют антивирусную реакцию. В настоящее время IFN-A, называются интерферонами типа III [1, 6]. После обнаружения в 2003 г. IFN-A, у человека их гены также были охарактеризованы. Анализируя аналогичные белки мыши, мы обнаружили, что
* Адресат для корреспонденции.
# Авторы внесли равный вклад в работу.
функциональными являлись только гены 1Ь28А и 1Ь28Б, тогда как ген 1Ь29 содержал терминирующий кодон в первом экзоне и характеризовался отсутствием экзона 2, а поэтому был нефункциональным [7, 8]. Размеры мышиных 1Ь-28А мРНК и 1Ь-28Б мРНК составляли 582 н. По своей первичной структуре мышиные 1Ь-28А и 1Ь-28Б имели степень идентичности между собой 97% и на 59—60% были идентичны соответствующим белкам человека [7].
Установлено, что 1РМ-А, подавляют репликацию многих вирусов и ослабляют их цитопати-ческое воздействие [9—15]. Кроме того, они оказывают положительное действие на факторы гистосовместимости МНС-1, презентирующие вирусные компоненты, и способствуют ликвидации зараженных вирусом клеток с помощью Т-киллеров [1, 16]. Помимо своей антивирусной активности, 1ЕМ-А, обладают способностью подавлять рост клеток. Механизм ингибирования клеточного роста под действием 1Ь-28/29 был обусловлен их проапоптотической и антипроли-
ЭКСПРЕССИЯ И ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА IFN-X3
281
феративной активностью in vitro [17—19]. Недавно мы обнаружили, что экспрессия IFN-A! под действием аденовирусов может снижать аллергическую реакцию и повышенную реактивность дыхательных путей [20], а гидродинамическая доставка гена IFN-X3 может уменьшать проявление патологических изменений в легких мышей, вызванные сигаретным дымом [21].
Для дальнейших исследований биологических функций IFN-A3 нам потребовалось большое количество мышиного интерферона-А,3 (mIFN-A,3). Поэтому был разработан эффективный метод получения рекомбинантного гибридного (His)6-mIFN-A,3, продуцируемого при экспрессии вектора pET-44-mIFN-A,3 в клетках E. coli и последующей очистки белка методом аффинной хроматографии с использованием №2+-НТА (нитрилотриацетат)-агарозы.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Конструирование вектора экспрессии. Для создания вектора экспрессии в качестве матрицы была использована плазмида Ex-Mm 18539-M03 («GeneCopoeia», Китай), несущая mIL-28B кДНК (регистрационный № в Генбанке AY869696). Район этой кДНК, кодирующий зрелый белок mIFN-A,3, был амплифицирован методом ПЦР. Для этого были использованы следующие прай-меры («Invitrogen», США): прямой 5'-GGAAT-TCCATATGGACCCTGTCCCCAGGGCCAC-3' (подчеркнут участок рестрикции Nde I, курсивом выделен ATG — кодон инициации трансляции) и обратный 5'-CCGCTGGAGGACACAC-TGGTCTCCACTGGC-3' (подчеркнут участок рестрикции Xho I). ПЦР проводили в следующем режиме: денатурация при 94° 5 мин; далее 30 циклов в следующих условиях: при 94° — 40 с, при 63,2° — 40 с, при 70,6° — 45 с и, наконец, удлинение цепи при 70,6° — 10 мин. Продукты ПЦР разделяли методом электрофореза в 1,2%-ном ага-розном геле, соответствующий фрагмент ДНК извлекали из геля и очищали с использованием набора Agarose Gel DNA Purification Kit («TaKaRa», Япония). Очищенный фрагмент был встроен в плазмиду pET-44 между участками рестрикции Nde I и Xho I. Результирующая рекомбинантная плазмида pET-44-mIFN-A,3 (рис. 1) была введена в клетки E. coli линии BL21 (DE3) («Novagen», Германия) с использованием стандартной процедуры. Трансформация бактериальных клеток была подтверждена методом ПЦР и рестрикци-онным анализом.
Экспрессия рекомбинантного mIFN-A,3. Вектор экспрессии pET-44-mIFN-A,3 был введен в клетки E. coli линии Rosetta (DE3) для получения
рекомбинантного гибридного белка mIFN-A,3, несущего фрагмент (His)6 на С-конце. Колонию успешно трансформированных клеток E. coli отбирали и наращивали культуру в среде Лурия— Бертани (LB, 0,5%-ный дрожжевой экстракт, 1%-ный бактотриптон, 1%-ный NaCl), содержащей 100 мкг/мл ампициллина, при 37° в течение ночи. Культуру разбавляли в соотношении 1/50 новой порцией свежей среды LB, содержащей ампициллин, и выращивали при встряхивании при 37° до достижения суспензией поглощения 0,4—0,6 при 600 нм. Для оптимизации времени экспрессии mIFN-A,3 культуру индуцировали 1 мМ изопропилтиогалактозидом (ИПТГ) и инкубировали в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 20 ч при 37°. Уровень экспрессии mIFN-АЗ определяли методом Ds-Na-ПААГ-электрофореза. Для выбора оптимального температурного режима клетки инкубировали при 37, 25, 20 или 18° в течение выбранного в предыдущем эксперименте оптимального времени экспрессии.
Получение клеточного лизата и очистка рекомбинантного белка mIFN-X3. Через 24 ч после начала индукции экспрессии при 20° клетки осаждали центрифугированием при 10 000 g в течение 10 мин при 4° и ресуспендировали при комнатной температуре в небольшом объеме реагента BugBuster Protein Extraction Reagent («Novagen») для получения суспензии, содержавшей 125 ед нуклеазы бензоназы («Novagen») на 1 г клеток, 5 тыс. ед/г клеток — лизоцима, 1 мМ фе-нилметилсульфонилфторид, и инкубировали при слабом встряхивании в течение 30 мин. Смесь
Рис. 1. Схематическое изображение вектора экспрессии pET-44-mIFN-X3
282 ВЕНГ и др.
центрифугировали при 16 000 g в течение 20 мин при 4° и использовали супернатант для дальнейшей очистки методом металлаффинной хроматографии.
Полученный супернатант смешивали в течение 90 мин при 4° с №+-НТА-агарозой («Qiagen», Германия), уравновешенной буфером с рН 8,0 (50 мМ №И2Р04, 500 мМ №С1, 20 мМ имида-зол). Смесь переносили в колонку и промывали буфером, рН 8,0 (50 мМ №И2Р04, 500 мМ №С1, 40 мМ имидазол, 30%-ный глицерин). Колонку элюировали буфером, рН 8,0 (50 мМ №И2Р04, 500 мМ N0, 250 мМ имидазол, 30%-ный глицерин). Не связавшиеся с колонкой и специфически элюированные белки анализировали методом Ds-Na-электрофореза в 12%-ном ПААГ и иммуноблоттинга. Для этого после проведения электрофореза белки переносили на поливинил-идендифторидные мембраны (Р\СР, «Mi11ipore», США). Мембраны блокировали 5%-ным БСА и инкубировали с моноклональными анти-(Иis)6 антителами («Novagen», разведение 1 : 2000) в течение 2 ч при комнатной температуре. В качестве вторичных антител были использованы кроличьи антимышиные IgG, коньюгирован-ные с пероксидазой хрена. Полосы иммуноре-активных белков визуализировали методом электрохемилюминесценции с использованием набора для ЕСЬ («Advansta», США).
Определение биологической активности mIFN-А3. Мышиные макрофаги линии RAW264.7 были получены из Американской коллекции клеточных культур («Манассас», США). Клетки культи-
вировали в среде Дульбекко (DMEM) в присутствии 10%-ной фетальной сыворотки крупного рогатого скота («Invitrogen-Life Technologies», США) и по 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина в атмосфере 5%-ной CO2 при 37°. Клетки (1 х 106/мл) высевали в 96-луночные планшеты по 2 х 105/в лунку в присутствии липополиса-харида (LPS, 200 нг/мл) и в присутствии или в отсутствие 5—500 нг/мл рекомбинантного mIFN-A3 и инкубировали в течение 24 ч. Концентрацию продуцирующегося IL-13 определяли с использованием набора для иммуноферментно-го анализа ELISA kit («ExCell Biology», Китай) в соответствии с прилагаемой инструкцией.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Конструирование вектора экспрессии рЕТ-44-
ш№^А3 кДНК, кодирующая зрелый белок ш№^А3, была получена методом ПЦР и клонирована между участками рестрикции Шг I и ХНо I в плазмидный вектор рЕТ-44. Полученный вектор экспрессии рЕТ-44-ш№^А3 нес промотор Т7 и последовательность, кодирующую гистидиновый тег, расположенную сразу за геном ш№^А3. Амплифицированный ген
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.