научная статья по теме ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ КОНСЕРВАТИВНЫЕ УЧАСТКИ ГЕНА AINTEGUMENTA В АНТИСМЫСЛОВОЙ ОРИЕНТАЦИИ Биология

Текст научной статьи на тему «ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ КОНСЕРВАТИВНЫЕ УЧАСТКИ ГЕНА AINTEGUMENTA В АНТИСМЫСЛОВОЙ ОРИЕНТАЦИИ»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2012, том 59, № 3, с. 341-353

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 581.1:577.214.625:578.853

ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ КОНСЕРВАТИВНЫЕ УЧАСТКИ ГЕНА ЛШТЕОиМЕтЛ В АНТИСМЫСЛОВОЙ ОРИЕНТАЦИИ © 2012 г. Б. Р. Кулуев, А. В. Князев, Я. П. Лебедев, Б. Н. Постригань, А. В. Чемерис

Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, Уфа Поступила в редакцию 01.04.2011 г.

Ген ЛШТЕОиМЕШТЛ кодирует транскрипционный фактор, принимающий участие в регуляции роста и развития как генеративных, так и вегетативных органов растений. Нами были амплифицированы и клонированы в антисмысловой ориентации два консервативных участка этого гена из арабидопсиса, рапса, табака и тополя. При помощи полученных генно-инженерных конструкций были созданы трансгенные растения табака с пониженным уровнем экспрессии гена Л1ШТЕОиМЕШТЛ. Более половины полученных трансгенных растений табака характеризовалось уменьшением размеров листьев, стеблей и цветков, при этом их форма и симметрия не изменялись. Трансгенные растения прекращали свой рост раньше контрольных, зацветали позже и отличались уменьшением количества цветков. Было показано, что основной причиной уменьшения органов у трансгенных растений явилось сокращение количества клеток, приходящихся на один орган, при этом размеры отдельных клеток оставались неизменными. Полученные нами генно-инженерные конструкции могут быть использованы для создания трансгенных растений различных видов с уменьшенными размерами органов.

Ключевые слова: ШсвНапа ?аЬасыш - трансгенные растения - ЛШТЕОиМЕШТЛ - транскрипционный фактор - посттранскрипционный сайленсинг - промотор вируса мозаики георгина - регуляция роста -величина органов

ВВЕДЕНИЕ

Несмотря на то, что величина органов растений сильно зависит от условий внешней среды, все же определяющее значение имеют особенности генотипа того или иного вида. Размеры органов растений контролируются двумя основными механизмами, а именно регуляцией клеточного деления и клеточного растяжения. Во время первой, так называемой пролиферативной фазы развития органа, происходит деление клеток и накопление цитоплазматической массы [1]. Затем процессы деления постепенно сменяются процессами растяжения, когда клетки начинают увеличиваться в размерах и происходит интенсивное поглощение воды центральной вакуоли. Очень часто процессы растяжения клеток сопряжены с эндоредупликацией, что также приводит к дальнейшему существенному увеличению размера органов [2]. Растяжение клеток регулируется, например, такими генами, как Л(ЕХР10, ЛЮК¥1, ЛКЬ, ВРЕр [3, 4]. Клеточная пролиферация также находится под жестким генетическим контролем,

Адрес для корреспонденции: Кулуев Булат Разяпович. 450054 Уфа, Проспект Октября, 71. Институт биохимии и генетики УНЦ РАН. Электронная почта: Kuluev@bk.ru

что было впервые показано на модельном объекте Arabidopsis thaliana при помощи экспериментов с повышением и подавлением уровня экспрессии исследуемых генов [1]. В регуляции клеточного деления участвуют гены AINTEGUMENTA (ANT), ARGOS [5], CYCLIND3;1 [6], AN3/GIF1 [7], WUS-CHEL, CLAVATA3 [8] и многие другие. Ген AINTEGUMENTA является одним из ключевых генов, контролирующих клеточную пролиферацию. Кодируемый им полипептид относится к транскрипционным факторам семейства AP2/ERF [9]. ANT содержит 2 копии ДНК-связывающего АР2-домена [9] и, видимо, контролирует экспрессию различных генов-регуляторов роста и развития, большинство из которых пока остаются неизвестными. Одним из генов-мишеней ANT является ген CYCLIND3;1, участвующий в контроле S-периода митотического цикла [10]. Однако ANT не только стимулирует клеточные деления, но также поддерживает меристематическую компетентность клеток апикальной и латеральных меристем [10], что говорит о наличии у него и других ДНК-мишеней. ANT локализован в ядре, он активирует транскрипцию при помощи N-терми-нального конца, при этом с ДНК связываются оба АР2-домена одновременно [11].

Транскрипция гена ANT регулируется белком ARGOS, экспрессия которого, в свою очередь, индуцируется фитогормоном ауксином [5]. Негативная регуляция экспрессии ANT на уровне трансляции осуществляется механизмом посттранскрипционного сайленсинга посредством miRNA172 [12]. Наибольший уровень экспрессии ANT обнаруживается в клетках примордиев листа, цветка и в апикальной меристеме [13]. Белковый продукт гена ANT является одним из самых ранних маркеров начала роста новых латеральных органов, поэтому считается, что ANT играет ключевую роль при закладке примордиев органов растений [13]. Даже в полностью дифференцированных органах эктопическая экспрессия ANT приводит к каллусообразованию, появлению добавочных корней и побегов [10].

Сверхэкспрессия ANT в арабидопсисе, в первую очередь, вызывает увеличение размеров цветка благодаря активации клеточных делений в чашелистиках и растяжению клеток в лепестках, тычинках и плодолистиках [14]. Кроме того, в последующих исследованиях было показано, что трансгенные растения, экспрессирующие ген ANT под контролем 35S промотора, характеризуются более быстрым развитием и большими размерами не только генеративных, но и вегетативных органов [10]. Причем эти данные были получены не только на трансгенном A. thaliana, но и на Nicotiana tabacum [10], относящимся к другому семейству, что говорит об определенной универсальности гена ANT, а также свидетельствует о его консервативности. Мутанты арабидопсиса ant отличались более медленным развитием и меньшими размерами всех органов цветка по сравнению с растениями дикого типа [14]. В семязачатках этих растений отсутствовали интегументы и функциональные зародышевые мешки, что было основной причиной стерильности этих растений. Также наблюдалось заметное ослабление клеточных делений и уменьшение количества меристе-матических клеток в примордиях цветков, что приводило к уменьшению количества цветков [14]. Экспрессия гомологов и ортологов гена ANT была обнаружена и исследована у N. tabacum [15], Aegilops crassa [16] и Gnetumparvifolium [17], что говорит о том, что этот ген универсален для всех высших растений.

Представляется необходимым как поиск гомологов гена ANT в хозяйственно важных растениях, так и исследование экспрессии этого гена в ге-терологичной среде в связи с возможностью получения новых теоретических данных, а также практического применения полученных знаний. Предполагается, что увеличивая уровень экспрессии гена ANT и его гомологов можно получить растения с увеличенными размерами органов. Создание трансгенных древесных растений с фрагментом гена ANT в антисмысловой ориента-

ции теоретически может стать новым способом ускоренного получения популярных "бонсай", на выращивание которых в настоящее время тратится значительное время и много усилий. Ранее нами был выделен полноразмерный ген AINTEGU-MENTA из Brassica napus и получены трансгенные растения табака с повышенным уровнем экспрессии этого гена [18]. Было обнаружено увеличение размеров вегетативных органов у некоторых трансгенных растений табака, экспрессирующих ген ANT рапса.

В настоящей работе описываются исследования, в ходе которых выделяли и изучали два консервативных участка гена ANT из арабидопсиса, рапса, табака и тополя. Эти участки ДНК были амплифицированы и клонированы в бинарных векторах в антисмысловой ориентации. Полученные генно-инженерные конструкции были проверены на трансгенных растениях табака. Предполагалось, что часть трансгенных растений будет отличаться существенным замедлением развития и уменьшением размера как вегетативных, так и генеративных органов. Наиболее эффективные генно-инженерные конструкции планируется применить в будущем для создания декоративных древесных растений с уменьшенными органами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные клетки, штаммы, плазмиды, генно-инженерные манипуляции, последовательности олигонуклеотидных праймеров. В работе использованы бактерии Escherichia coli штамма XL1-Blue и Agrobacterium tumefaciens штамма AGL0. Из плазмид использовали Т-векторы pKRX и pAL-TA, бинарные векторы pCambia 2301 с геном устойчивости к канамицину, pCambia 1301 и pCambia 1305.1 с геном устойчивости к гиг-ромицину ("CAMBIA", Австралия). Тотальную ДНК арабидопсиса, рапса, тополя и табака выделяли методом солевой экстракции [19]. Выделенную таким образом ДНК растений очищали при помощи набора для очистки ДНК фирмы "Цито-кин" (Россия) и использовали в качестве матрицы при проведении ПЦР. Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса бактериальных колоний при помощи набора фирмы "Цитокин". Расщепление ДНК проводили при помощи различных эндонуклеаз рестрикции в буферах, рекомендованных фирмами-поставщиками ("Сибэнзим", Россия; "Fermentas", Литва). Лигирование осуществляли при помощи Т4 ДНК-лигазы ("Силекс", Россия). Качество и количество выделенных препаратов определяли аналитическим электрофорезом в 1% агарозном геле. Агарозный гель-электрофорез проводили в приборах модели Sub-Cell GT WIDE MINI ("BioRad", США). Элюцию фрагментов ДНК прово-

дили из легкоплавкой агарозы или при помощи набора для очистки ДНК ("Цитокин"). Для ПЦР использовали амплификаторы производства компании "ДНК-технология" (Россия). Для амплификации первого консервативного участка гена ANT использовали подобранные нами универсальные праймеры ANTReglF TTTTCATAT-GAAATCTATTGATAC и ANTReglR TTTCCTTC-CTTTTCTACTCTGACC, при этом размер этого участка с интронами для различных растений составляет около 230 п.н. Второй консервативный участок выделили при помощи праймеров ANTReg2F GAGAATTATCAGAAAGAGATTG и ANTReg2R GTTACTCCTCTATAGATTGAAG, он не содержит интронов и его размер составляет около 120 п.н. Для выделения участка гена ANT рапса размером 314 п.н. использовали праймеры

ANTantpR GAGTGAGAAGATCTGTTGAG. Для получения ампликонов консервативных участков гена ANT с "тупыми" концами и для "затупления" липких концов после рестрикции использовали Т4-ДНК-полимеразу ("Сибэнзим"). При конструировании вектора pCambia 1301 и клонирования в нем различных генов использовали праймеры 35SCambF: ATATTACCTAACA-TA

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком