научная статья по теме ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ ХИМИЯ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА GFP Химия

Текст научной статьи на тему «ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ ХИМИЯ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА GFP»

БИОХИМИЯ, 2009, том 74, вып. 3, с. 309 - 319

УДК 577.122

ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ ХИМИЯ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА GFP

Мини-обзор © 2009 г. А.А. Пахомов, В.И. Мартынов*

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; факс: (495)335-7103, электронная почта: vimart@list.ru

Поступила в редакцию 12.09.08 После доработки 28.10.08

Рассмотрены современные представления о посттрансляционной химии, обусловливающей разнообразие оптических свойств белков семейства ОБР.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: посттрансляционные модификации, флуоресценция, хромофор, ОБР, ВвЯеё, КБР, Каеёе.

Посттрансляционные модификации (ПТМ) — один из важнейших способов регуляции биологической активности белков и ферментов. По характеру протекающих реакций можно выделить три основные категории ПТМ: протеоли-тическое расщепление полипептидной цепи (удаление сигнальных последовательностей, последовательностей белка, определяющих его внутриклеточную локализацию, автокаталитическое выщепление интеинов), присоединение химической группы небелковой природы (фос-форилирование, гликозилирование, пренили-рование и т.д.), а также образование интер- и интрамолекулярных связей (дисульфидные связи, лигирование экстеинов и т.д.). ПТМ происходят при участии специализированных ферментов, осуществляющих процессинг полипептида, а также за счет автокатализа. Все известные к настоящему времени модификации белка представлены в базе данных RESID (http:// www.ncifcrf.gov/RESID/) [1]. Некоторые фермен-

Принятые сокращения: ПТМ — посттрансляционные модификации; avGFP — зеленый флуоресцентный белок из Aequorea victoria; п-ГБИ — 4-(п-гидроксибензили-ден)имидазолид-5-он; DsRed — красный флуоресцентный белок из Discosoma sp.; Kaede — флуоресцентный белок из Trachyphyllia geoffroyi; DendFP — флуоресцентный белок из Dendronephthya sp.; EosFP — флуоресцентный белок из Lobophyllia hemprichii; KikG — флуоресцентный белок из Favia favus; zFP538 — желтый флуоресцентный белок из Zoanthus sp.; asFP595 — фотоактивируемый белок из Anemonia sulcata; z2FP574 — красный флуоресцентный белок из Zoanthus sp. 2.

* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.

ты не нуждаются в экзогенных кофакторах и используют кофакторы, которые являются производными белковых структур, полученными в результате ПТМ [2]. К последней группе относятся и белки семейства GFP, хромофор которых синтезируется автокаталитически за счет посттрансляционных реакций, не требующих экзогенных кофакторов, за исключением молекулярного кислорода [3]. Таким образом, автокаталитические ПТМ белков семейства GFP лежат в основе их уникальной способности «самонастройки» на определенный спектральный диапазон [4]. Это свойство используется в современной молекулярной и клеточной биологии для мечения клеточных объектов [5].

Первый представитель семейства GFP, зеленый флуоресцентный белок, был обнаружен в 1961 г. в фотоцитах биолюминесцентной медузы Aequorea victoria [6], принадлежащей к классу Hydrozoa. В 1999 г. из нелюминесцирующих кораллов класса Anthozoa были клонированы гены белков, гомологичных GFP и проявляющих флуоресценцию в более длинноволновой области спектра [7]. Несмотря на достаточно отдаленную гомологию первичных структур (~20%), флуоресцентные белки из кораллов обладают значительной гомологией третичных структур. Как и GFP, молекулы белков-гомологов имеют форму цилиндра, стенки которого состоят из 11 сегментов р-складчатых структур. Через центральную ось этого цилиндра проходит а-спи-раль, содержащая последовательность аминокислот —Xxx—Tyr—Gly—, из которых в дальнейшем образуется хромофор. После образования

цилиндрической структуры белок вступает в фазу созревания, которая характеризуется автокаталитическими реакциями в пределах последовательности —Ххх—Туг—О1у—, приводящими к синтезу хромофора и определяющими флуоресцентные свойства данного белка. В результате этих реакций в ОБР образуется хромофор, 4-(п-гидроксибензилиден)имидазолид-5-он (п -ГБИ), который в пространстве расположен в центре цилиндра (схема 1, структура VI). п-ГБИ является также исходным соединением при дальнейшем синтезе хромофоров белков-гомологов из кораллов. В последнем случае п-ГБИ подвергается дополнительным ПТМ, которые вносят изменения в его сопряженную п-электронную систему.

За последние несколько лет накоплено много экспериментального материала, способствующего более глубокому пониманию биохимических основ синтеза хромофоров в белках семейства ОБР. Понимание биохимических механизмов необходимо для создания молекулярной модели в целях направленного воздействия на фотофизические свойства этих белков. Данный обзор обобщает современные представления о посттрансляционных реакциях, обусловливающих разнообразие оптических свойств белков семейства ОБР.

ОБРАЗОВАНИЕ ХРОМОФОРА GFP

Реакция циклизации полипептидной цепи. Первоначально предполагалось, что ПТМ полипептидной цепи с образованием имидазолид-5-он-структуры уникальна и характерна только для белков семейства GFP. Однако недавние исследования показали, что гистидинаммонийлиаза (HAL) [8], фенилаланинаммонийлиаза (PAL) [9], а также тирозинаминомутаза (TAM) [10] используют подобную реакцию для синтеза электрофиль-ного остатка метилиден-имидазолид-5-он в активном центре ферментов [11]. В белках семейства GFP синтез п-ГБИ происходит в три основные стадии: циклизации с образованием кова-лентной связи между атомом азота Gly67 и карбонильным углеродным атомом аминокислоты Xxx трипептида —Xxx65—Tyr66—Gly67—, дегидратации и окисления с последующим образованием экзоциклической связи С=С (схема 1) [12].

Посттрансляционная модификация белков семейства GFP начинается с того момента, как полипептид приобретает цилиндрическую р-складчатую пространственную структуру. В этой структуре центральный a-спиральный сегмент имеет значительные искажения в виде изгиба в районе хромофоробразующего трипепетида

—Ххх—Туг—О1у—. Предполагается, что именно эти искажения инициируют автокаталические ПТМ белков семейства ОБР [13]. С помощью рентгеноструктурного анализа мутантов ОБР до и после реакции циклизации было показано, что в результате образующегося изгиба значительно сближаются атомы азота О1у67 и карбонильного углерода аминокислоты Ххх65, которые в дальнейшем участвуют в этой нуклео-фильной реакции. Кроме того, в области изгиба не образуются водородные связи, характерные для неискаженной а-спирали, что значительно снижает энергетический барьер реакции [13].

Хромофор белков семейства ОБР находится в полости, состоящей из аминокислот, которые влияют на распределение электронной плотности и заряда в пределах его конъюгированной п-системы [14, 15]. Эти аминокислоты во многом определяют оптические свойства конкретного белка. Очевидно, в этой же полости располагаются аминокислоты, осуществляющие катализ реакций образования хромофора. Подавляющее большинство белков семейства ОБР содержит инвариантные Ащ96 и О1и222 в непосредственной близости от хромофора (схема 1). Предполагается, что Ащ96 участвует в образовании изгиба в области хромофоробразующей последовательности, а также способствует депротони-рованию амидного атома азота О1у67, увеличивая его нуклеофильную силу (схема 1, структура I). Кристаллографические исследования мутанта, содержащего хромофоробразующую последовательность —О1у—О1у—О1у—, в предшествующем циклизации состоянии показывают, что боковая цепь А^96 препятствует образованию водородных связей между аминокислотами, находящимися в позициях 62 и 66, а также 65 и 68 а-спирали [13]. Замена Ащ96 на аланин или метионин с помощью направленного мутагенеза приводит к существенному замедлению реакции образования хромофора [16, 17]. Установлено, что положительно заряженная гуанидиновая группа Ащ96 во всех белках семейства ОБР образует водородную связь с карбонильным кислородом Туг66, существенно снижая энергию активации реакции циклизации [3, 13, 17]. Аминогруппа Lys96 мутанта Я96К не образует водородной связи с карбонильной группой Туг66 [17]. В данном случае активационная роль А^96 лишь частично компенсируется заменой на остаток лизина в этом положении [18]. Таким образом, считается, что А^96 вызывает структурные перестройки, необходимые для совмещения электронных орбиталей перед циклизацией, способствует депротонированию атома азота О1у67, увеличивая его нуклеофильность, а также стабилизирует иминольный интермедиат в процессе цик-

Схема 1. Механизм биосинтеза хромофора зеленого флуоресцентного белка. Справа и слева представлены две альтернативные схемы биосинтеза п-ГБИ

лизации (схема 1, структура I) [19]. Также было показано, что А^96 может способствовать образованию циклического енолята (схема 1, структура IV) на других стадиях синтеза хромофора, что подробнее описано ниже.

Аминокислотный остаток О1и222 также играет значительную роль в катализе циклизации полипептидной цепи. Замена E222Q заметно снижает скорость реакции при физиологических значениях рН. Однако скорость реакции для этого мутанта существенно возрастает при рН 9—10. Согласно предложенной кинетической модели скорость реакции определяется в значительной мере химической группой, обладающей основными свойствами с рКа 9,2. В этой работе предполагается, что в природном белке ауОБР О1и222 функционирует как сопряженное основание, способствуя в дальнейшем образованию промежуточного енолята [16].

Дегидратация и окисление. Поскольку циклизация полипептидной цепи — термодинамически невыгодный процесс [13], предполагается, что его движущей силой являются последующие реакции. В результате реакции дегидратации образуется соединение с резонансно-стабилизированной п-электронной системой (схема 1, структура IV), что, по-видимому, является причиной сдвига равновесия в сторону циклического продукта [13]. Предполагается также, что реализации такого механизма «конъюгирующей ловушки» способствует дальнейшее окисление Са—Ср-связи Туг66 с образованием ароматической системы имидазолид-5-он-гетероцикла и ее конъюгацией с фенольным кольцом Туг (схема 1, структура VI). Действительно, рентге-ноструктурные исследования му

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»