ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2010, том 36, № 1, с. 117-121
УДК 577.112:577.336
ПОСТТРАНСЛЯЦИОННЫЕ РЕАКЦИИ, ПРИВОДЯЩИЕ К СМЕЩЕНИЮ СПЕКТРОВ БЕЛКА asFP595 ИЗ Anemonia sulcata В ДЛИННОВОЛНОВУЮ ОБЛАСТЬ © 2010 г. А. А. Пахомов, Ю. А. Третьякова, В. И. Мартынов*
Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 30.04.2009 г. Принята к печати 02.06.2009 г.
В большинстве флуоресцентных белков, характеризующихся поглощением и эмиссией света в красной и дальне-красной области спектра (550—650 нм), расширение п-системы хромофора осуществляется за счет дополнительного окисления GFP-подобной структуры и образования ацил-иминного заместителя. В отличие от этих белков, ацилимин в хромофоре фотоактивируемого белка asFP595 заменен на кето-группу. В настоящей работе изучены реакции, приводящие к батохромно-му сдвигу в спектре asFP595. Анализ кинетики созревания показал, что аналогично другим красным флуоресцентным белкам на промежуточной стадии образуется незрелая форма, содержащая прото-нированный хромофор (поглощение при 420 нм), которая изобестически превращается в конечную зрелую форму (568 нм). Масс-спектрометрический анализ хромопептида, выделенного из незрелого asFP595, показал, что промежуточная форма содержит хромофор GFP-типа. Также установлено, что в ходе окисления GFP-хромофора происходит выделение эквимольного количества пероксида водорода. Для анализа промежуточных продуктов реакции окисления был проведен мутагенез первого хромофоробразующего остатка. Показано, что во всех изученных мутантах синтез хромофора не останавливается на стадии ацилиминного производного, а приводит сразу к фрагментации основной цепи белка и образованию кето-формы.
Ключевые слова: DsRed; фотоактивируемый белок; Anemonia sulcata; флуоресцентные белки; ацилимин; asFP595; хромофор.
ВВЕДЕНИЕ
Белки семейства ОБР находят все более широкое применение в современной молекулярной и клеточной биологии как генетически кодируемые флуоресцентные зонды и используются для решения широкого спектра задач: от индикации генной экспрессии и использования в качестве биосенсоров и маркеров до исследования белок-белковых взаимодействий [1, 2]. Одной из наиболее значимых фундаментальных задач в биохимии этих белков в настоящее время является выяснение механизмов посттрансляционньи реакций, приводящих к бато-хромным сдвигам в их спектрах [3]. Красные флуоресцентные белки представляют значительный интерес для клеточных биологов благодаря меньшему уровню автофлуоресценции клетки в этом диапазоне спектра. Более того, ткани животных наиболее прозрачны в дальне-красном и инфракрасном диапазоне (650—900 нм). Поэтому белки, обладающие эмиссией в этой области спектра, позволяют изучать процессы в рамках целого организма.
Механизмы образования хромофоров в различных красных флуоресцентных белках могут значительно отличаться [4]. Так, в некоторых случаях протекает фотоэлиминирование с образованием двойной связи в боковой цепи первого хромофор-образующего остатка гистидина [5—7]. В боль-
# Автор для связи (тел.: (495) 336-51-11; эл. почта: vimart@list.ru).
шинстве красных флуоресцентных белков и их нефлуоресцирующих гомологов GFP-подобная структура подвергается дополнительному автокаталитическому окислению либо окислительному декарбоксилированию с образованием ацилиминного заместителя, расширяющего я-систему GFP-хромофора [8—11]. Ацилимин, будучи довольно ре-акционноспособной группой, зачастую вступает в дополнительные посттрансляционные реакции и может быть дополнительным источником спектральной вариабельности. К примеру, в мягких и жестких денатурирующих условиях возможно присоединение воды к С=М-связи ацилимина и последующий его распад в результате полного гидролиза [12]. По такой же схеме, по-видимому, протекает автокаталитическая реакция синтеза хромофора белка asFP595 из Anemonia sulcata с последующим расщеплением полипептидной цепи на два фрагмента [13, 14]. За счет нуклеофильных реакций по ацил-имину образуются также хромофоры в белках zFP538, mOrange и mKO [15-18].
Таким образом, химия ацилимина играет ключевую роль в реакциях модификации хромофора. Один из важнейших этапов — это окисление первого хромофоробразующего остатка, приводящее к синтезу ацилимина. Особенно важно, что окислительные реакции являются скоростьлимитирую-щей стадией в ходе образования хромофоров белков семейства GFP [19, 20]. В этом контексте важно знать механизмы этих реакций, так как увеличен-
118
ПАХОМОВ и др.
ные времена синтеза хромофоров могут значительно ограничивать применение этих белков при исследовании внутриклеточных процессов в реальном времени. В настоящей работе мы провели исследование реакций, приводящих к образованию хромофора в фотоактивируемом белке а8БР595.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для определения последовательности реакций в синтезе хромофора азБР595 была изучена кинетика созревания белка. С этой целью был получен незрелый белок (не имеющий поглощения в видимой области спектра), и за синтезом хромофора наблюдали по изменению спектров поглощения (рис. 1). Изменение спектров поглощения белка в процессе его созревания показывает, что конечная форма хромофора, поглощающая при 568 нм, образуется из промежуточной формы с максимумом при 420 нм. Аналогичная картина наблюдалась при изучении кинетики созревания красного флуоресцентного белка DsRed и хромобелков ^СР и е§СР [21]. Однако три последних белка имеют типичный для красных флуоресцентных белков хромофор, содержащий ацили-мин (хромофор DsRed-типа). Спектры созревания asFP595 характеризуются изобестической точкой при переходе из формы 420 в 568 нм, что свидетельствует об исключительно коротких временах жизни промежуточных соединений либо их отсутствии.
Мы проанализировали структуру хромофора формы asFP595, поглощающей при 420 нм. Для этого белок на промежуточной стадии созревания денатурировали и подвергали протеолитическому расщеплению пепсином. Хромофорсодержащий пептид выделяли при помощи ВЭЖХ и анализировали масс-спектрометрически. Известно, что хромофор GFP и других зеленых флуоресцентных белков при денатурации в кислых условиях имеет максимум поглощения при 380 нм, а в щелочной среде максимум поглощения находится при 450 нм. Выделенный хромопептид демонстрировал схожее поведение и имел максимум поглощения при 380 нм, который при защелачивании смещался к 450 нм. Масса полученного хромопептида составила 1406.3 Да (m/z 1407.3), что на 20 Да меньше теоретической массы пептида HILSTSCMYGSKT (1426.6 Да). Такая потеря в массе наблюдается в ходе синтеза хромофора GFP и возникает в результате посттрансляционных реакций дегидратации и окисления хромофоробра-зующей последовательности аминокислот [22]. Максимум в спектрах поглощения при 420 нм свидетельствует о протонировании фенольной группы хромофора этой промежуточной формы [23]. Таким образом, согласно кинетическому анализу, в случае asFP595 конечный хромофор (схема, структура (V)) образуется из промежуточного протонированного GFP-подобного хромофора (схема, структура (III)).
указана A,max поглощения.
Ранее предполагалось, что хромофор красного флуоресцентного белка DsRed образуется при окислении протонированного GFP-подобного хромофора в присутствии О2 [10, 21]. Для изучения приро-
ды окислительной реакции при образовании зрелой формы asFP595 мы использовали метод детекции перекиси водорода, которая должна выделяться в ходе окисления хромофора кислородом. Аналогич-
ный подход был ранее использован при изучении реакций синтеза хромофора GFP [24]. На стадии образования формы белка с поглощением 420 нм к образцу добавляли реагент AmplexRed и пероксидазу хрена, катализирующую окисление AmplexRed перекисью. По количеству образовавшейся окисленной формы AmplexRed проводили оценку выделившейся в ходе синтеза хромофора перекиси.
Однако детекция перекиси, способной выделяться на стадии превращения GFP-хромофора в конечную кето-форму, осложняется тем, что синтез самого GFP-хромофора (схема, структура (III)) сопровождается также выделением пероксида. Чтобы учитывать образование перекиси только на последней стадии, детекцию начинали с момента появления изо-бестической точки в спектрах поглощения белка. В этом случае происходит только один процесс — превращение 420 нм-формы (GFP-хромофора) в конечную 568 нм-форму, а вклад первой реакции исключительно мал. Оказалось, что превращение хромофора из формы 420 нм в конечную зрелую сопровождается эквимольным выделением перекиси водорода (нами было определено молярное соотношение H2O2 : asFP595, равное 0.96). В случае измерения выделившейся перекиси до возникновения изобестической точки было установлено соотношение H2O2 : белок, равное 1.4, что свидетельствует о выделении перекиси также и на стадии образования формы (III). Таким образом, на основании приведенных здесь данных можно заключить, что на промежуточной стадии синтеза образуется хромофор GFP-типа (схема, структура (III)), который далее окисляется с выделением эквимольного количества перекиси водорода. Наиболее вероятным дополнительным промежуточным продуктом этой реакции может быть ацилиминзамещенный хромофор (схема, структура (IV)). Кето-заместитель (схема, структура (V)), по-видимому, образуется в результате гидролитического расщепления ацилимина, однако из-за высокой скорости реакции детектировать ацили-мин (IV) не удается и наблюдается "изобестическое" образование конечной формы.
Далее, для идентификации промежуточного ацилиминного производного (IV) хромофора были предприняты попытки "выключить" последнюю реакцию гидролиза ацилимина с помощью мутагенеза asFP595. Прежде всего, мы осуществили замену первого хромофоробразующего аминокислотного остатка Met63. Остальные два хромофоробразу-ющих остатка Tyr64 и Gly65 консервативны в природных флуоресцентных белках и необходимы для синтеза хромофора. Ранее нами было показано, что природа первого хромофоробразующего остатка может сильно влиять на выход продуктов гидролиза ацилимина при денату
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.