МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2008, том 42, № 1, с. 96-101
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.2:616.006
ПОТЕРЯ ГЕТЕРОЗИГОТНОСТИ И МИКРОСАТЕЛЛИТНАЯ НЕСТАБИЛЬНОСТЬ В СТРОМАЛЬНЫХ И ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
© 2008 г. Т. В. Кекеева1' 2, О. П. Попова2, П. В. Шегай3, Л. Э. Завалишина3, Ю. Ю. Андреева3, Д. В. Залетаев1, 2*, М. В. Немцова1, 2
1Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук, Москва, 115478 2Научно-исследовательский институт молекулярной медицины при Московской медицинской академии
им. И.М. Сеченова, Москва, 119992 3Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена, Москва, 125284
Поступила в редакцию 27.03.2007 г.
Принята к печати 13.04.2007 г.
За последнее десятилетие интенсивного изучения опухолевого микроокружения получены многочисленные данные, свидетельствующие о критической роли стромы в канцерогенезе. Накопление генетических нарушений характерно не только для опухолевого эпителия, но и для ассоциированных с опухолью фибробластов. С применением технологии лазерной микродиссекции мы разделили эпителиальный и стромальный компоненты рака предстательной железы и провели микросател-литный анализ хромосомных районов 8р22, 13q14 и 16q23 в неопластических и стромальных клетках при раке предстательной железы и предраковых изменениях. В эпителии частота аллельных нарушений в локусах 8р22, 16q23 и 13q14 составила 48, 72 и 37% соответственно. В строме частота потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности в этих локусах была немного выше. В небольшом количестве молекулярные перестройки обнаружены как в эпителиальном (от 16 до 27%), так и в стромальном компоненте простатической интраэпителиальной неоплазии (от 7 до 22%). Выявлены статистически достоверные ассоциации потерь аллелей на хромосомах 16 и 13 в эпителии со степенью дифференцировки опухоли, стадией злокачественного процесса и метастазами в регионарных лимфоузлах. Результаты нашей работы свидетельствуют о том, что в строме рака предстательной железы происходят многочисленные мутационные события, частота которых не уступает частоте в опухолевом эпителии.
Ключевые слова: рак предстательной железы, микродиссекция, потеря гетерозиготности, микро-сателлитная нестабильность, строма опухоли.
FREQUENT ALLELIC LOSSES IN TUMOR-ASSOCIATED STROMAL CELLS AND TUMOR EPITE-LIUM OF PROSTATE CANCER, by T. V. Kekeeva1 2, O. P. Popova2 , P. V. Shegai3, L. E. Zavalishina3, Y. Y. Andreeva3, D. V. Zaletaev1 2, M. V. Nemtsova1 2 (1Medical Genetic Research Centre, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, 115478 Russia, *e-mail: zalnem@online.ru; 2Institute of Molecular Medicine, Sechenov Medical Academy, Moscow, 119992 Russia; 3Moscow Herzen Oncological Research Institute, Moscow, 125284 Russia). It has become increasingly clear that tumor microenvironment plays a critical role in carcinogenesis. Accumulation of genetic alterations is typical not only for cancer epithelial cells but tumor-associated fibroblasts as well. Tumor epithelia, tumor-associated stroma from prostatectomy specimens of patients with prostate cancer and cells from prostatic intraepithelial neoplasia (PIN) and adjacent stroma from males with PIN were isolated by using laser capture microdissection. Microsatellite allelotyping was evaluated using 4 highly polymorphic markers for chromosomal regions 8p22, 16q23-24 and 13q14. Incidences of alterations (loss of heterozygosity or allelic imbalance) were 48% for region 8p22, 72% for 16q23 and 37% for 13q14. The LOH frequencies in tumor-associated stroma cells were very similar. Alterations at chromosome 13q were significantly associated with advanced tumor stage, whereas AI at 16q was also associated with high Gleason score and lymph node metastasis. We find some incidences of allelic imbalance in premalignant lesions in epithelial (16-27%) and stromal (7-22%) components. Our results show that the frequencies of genetic aberrations are as high in stromal cells as in tumor cells.
Key words: prostate cancer, laser capture microdissection, loss of heterozygosity, allelic imbalance, tumor microenvironment.
Принятые сокращения: ПЖ - предстательная железа; РПЖ - рак предстательной железы; ПИН - простатическая интра-эпителиальная неоплазия; ПГ - потеря гетерозиготности, МН - микросателлитная нестабильность.
*Эл. почта: zalnem@online.ru
Рак предстательной железы (РПЖ) - одно из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований у мужчин [1]. Молекулярный механизм ключевых этапов раннего патогенеза РПЖ не ясен. Однако за последнее десятилетие интенсивного изучения опухолевого микроокружения получено большое число убедительных данных, свидетельствующих о критической роли стромы в канцерогенезе [2-4].
Развитие нормальных и неопластических железистых структур ПЖ строго контролируется и регулируется путем мезенхимально-эпителиаль-ных взаимодействий [5]. Опухолевая прогрессия зависит не только от молекулярных изменений эпителиальных клеток, но и от многочисленных изменений смежной стромы, обеспечивающей окружение, необходимое для пролиферации, миграции, инвазии опухолевого эпителия в процессе неопластического роста. Изменения, происходящие в строме, включают изменения в уровне экспрессии факторов роста, цитокинов, преобразования в цитоскелете фибробластов и внеклеточном матриксе [2]. Накопление многочисленных генетических нарушений характерно не только для опухолевого эпителия, но и для ассоциированных с опухолью фибробластов [6-10]. Такие повреждения генома стромальных клеток, как гиперметилирование генов-супрессоров, изменение длины теломер, делеции и микросателлитная нестабильность (МН) на различных хромосомах, мутации, имеют свой особенный профиль и не повторяют генетическую патологию опухолевого эпителия [11-16]. В число самых частых нарушений в эпителиальных опухолях входят как гомозиготные, так и гетерозиготные делеции, для обнаружения которых применяется микросателлит-ный анализ потери гетерозиготности (ПГ).
С применением технологии лазерной микро-диссекции мы разделили эпителиальный и стро-мальный компоненты РПЖ. Для оценки частоты генетических нарушений в опухолевом эпителии и смежной строме и их сравнения выбрали хромосомные районы 8р22, 13q14 и 16q23, как наиболее часто повреждаемые при РПЖ [17-20]. На образцах РПЖ, а также при предраковых изменениях простатической интраэпителиальной неоплазии (ПИН) провели анализ ПГ/МН этих хромосомных районов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Образцы ткани ПЖ и образцы периферической крови (5 мл) получены от 33 человек с диагнозом РПЖ, подвергшихся радикальной простат-эктомии в отделении онкоурологии Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А. Герцена. Еще 19 образцов ткани ПЖ получены при выполнении мультифокальной биопсии у больных с ПИН. Гистологическое ис-
Таблица 1. Характеристики микросателлитных маркеров
Маркер Хромосома Гетерози-готность Повтор
D8S1731 8p22 0.84 Динуклеотидный
D16S534 16q23 0.80 Тетрануклеотидный
D16S422 0.80 Динуклеотидный
RB1.20 13q14 0.94 Тетрануклеотидный
следование ткани выполнено в патологоанатоми-ческом отделении того же института. Средний возраст больных составил 63 года. Средний балл по шкале Глиссона - шесть (от четырех до восьми). Образцы ткани замораживали при -70°С, а также фиксировали в формалине с последующей парафинизацией.
Микродиссекцию выполняли на 5 мкм срезах, фиксированных формалином и окрашенных гематоксилином-эозином, с помощью системы лазерной микродиссекции ASLMD (Leica microsystems, Германия). Под контролем патолога материал железистых структур, содержащих более 80% неопластических клеток (аденокарциномы, ПИН), а также близлежащей стромы вырезали лазером со срезов и собирали в отдельные пробирки (рис. 1). ДНК выделяли методом, описанным ранее [21].
Геномную ДНК из лейкоцитов периферической крови выделяли методом фенол-хлороформной экстракции [22].
Микросателлитный анализ. ПГ и МН в хромосомных районах 8р22, 13q14 и 16q23 идентифицировали с использованием четырех высокополиморфных маркеров D8S1731, RB20int (внутриген-ный маркер RB1), D16S534, D16S422 (табл. 1). Контролем служила ДНК лейкоцитов периферической крови. ПЦР проводили по следующей схеме: к 0.1 мкг геномной ДНК добавляли 0.05 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезок-синуклеотидтрифосфата, 1-2 ед. акт. Taq-поли-меразы, 50 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (pH 8.4), 5 мМ MgCl2. Затем добавляли 30 мкл вазелинового масла, прогревали смесь при 95 °С в течение 10 мин и проводили 33 цикла по следующей программе: денатурация при 95°С - 30 с, отжиг и элонгация при 58-60°С - 2 мин 30 с. Нук-леотидная последовательность праймеров и режимы отжига представлены в табл. 2. Продукты ПЦР разделяли в 6%-ном денатурирующем по-лиакриламидном геле и окрашивали нитратом серебра. ПГ оценивали как ослабление или отсутствие полосы одного из аллелей по сравнению с
Рис. 1. Лазерная микродиссекция образца рака предстательной железы. Стрелками указаны области микродиссекции: аденокарцинома (Ад), ПИН и смежная строма (Стр). Обработка срезов для лазерной микродиссекции, окраска гематоксилин-эозином. Увеличение х100.
контролем, на МН указывало появление дополнительной полосы (рис. 2).
Статистическую обработку данных проводили при помощи программы Graph Pad Instat 3.05. По гистологическому критерию (РПЖ, ПИН), степени дифференцировки по Глиссону (от четырех до шести баллов и более семи), по стадиям (I—II, III и IV) и по наличию метастазов больных объединяли в группы и сравнивали в этих группах частоты потерь аллелей в каждом локусе с помощью точного критерия Фишера.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Проведен микросателлитный анализ хромосомных районов 8р22, 13q14 и 16q23 в неопластических и стромальных клетках при РПЖ и предраковых изменениях.
Таблица 2. Нуклеотидные последовательности прай-меров
Локус Праймер Температура отжига, °C
D8S1731 F: cca agc aaa tca tgg aaa tc R: agc aaa ctt atc cca caa gg 58
D16S534 F: caa caa agc aag acc ctg tc R: cat ctg cgg tt
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.