ЖУРНАЛ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ, 2011, том 61, № 3, с. 332-339
ФИЗИОЛОГИЯ ПОВЕДЕНИЯ;
ОБУЧЕНИЕ И ПАМЯТЬ
УДК 577.112:591.51:591.144.4:591.481
ПОВЕДЕНИЕ В ТЕСТЕ ВЫНУЖДЕННОГО ПЛАВАНИЯ И ЭКСПРЕССИЯ В МОЗГЕ КРЫС ГЕНОВ НЕЙРОТРОФИЧЕСКОГО ФАКТОРА (BDNF) И АНТИАПОПТОЗНОГО БЕЛКА Bcl-xl
© 2011 г. И. В. Берeзова, Г. Т. Шишкина, Т. С. Калинина, Н. Н. Дыгало
Лаборатория функциональной нейрогеномики Института цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск,
e-mail: gtshi@bionet.nsc.ru Поступила в редакцию 01.03.2010 г.
Принята в печать 18.10.2010 г.
Через сутки после однократного вынужденного плавания у крыс во фронтальной коре снижалась экспрессия мозгового нейротрофического фактора (BDNF), а в гиппокампе и миндалине повышалась экспрессия гена антиапоптозного белка Bcl-xl. При этом животные проявляли де-прессивноподобное поведение и имели повышенный уровень кортикостерона в крови. Между уровнем мРНК BDNF в коре и продолжительностью пассивного поведения выявлена достоверная отрицательная корреляция. Через сутки после повторного плавания был увеличен уровень мРНК BDNF в гиппокампе. Данные свидетельствуют о взаимосвязи снижения экспрессии BDNF во фронтальной коре с развитием индуцированного стрессом депрессивноподобно-го состояния. Увеличение уровней мРНК BDNF и Bcl-xl, очевидно, является частью защитного механизма, направленного на преодоление повреждающих эффектов стресса на мозг.
Ключевые слова: мРНК, BDNF, Bcl-xl, тест вынужденного плавания, гиппокамп, фронтальная кора, миндалина.
Behavior in the Forced-Swimming Test and Expression of BDNF and Bcl-xl Genes in the Rat Brain
I. V. Berezova, G. T. Shishkina, T. S. Kalinina, N. N. Dygalo
Institute of Cytology and Genetics, Russian Academy of Sciences, Siberian Division, Novosibirsk,
e-mail: gtshi@bionet.nsc.ru
A single exposure of rats to the forced-swimming stress decreased BDNF mRNA levels in the cortex and increased Bcl-xl gene expression in the hippocampus and amygdala 24 h after the stress. The animals demonstrated a depressive-like behavior and elevated blood corticosterone level. There was a significant negative correlation between BDNF mRNA level in the cortex and immobility time during swimming. Repeated exposure to swimming stress caused the elevation of the hippocampal BDNF mRNA level assessed 24 h after the second swimmimg session. The data suggest that stress-induced down-regulation of cortical BDNF gene expression and behavioral despair in the forced-swimming test may be interrelated. The increase in the BDNF and Bcl-xl mRNA levels may contribute to the mechanisms protecting the brain against negative effects of stress.
Keywords: mRNA, BDNF, Bcl-xl, forced-swimming test, hippocampus, frontal cortex, amygdala.
Стресс способен провоцировать возникновение депрессии [12, 16]. Среди механизмов этого психоэмоционального расстройства, индуцированного стрессом, рассматривают ослабление нейрогенеза и усиление апоптоза в мозговых структурах, прежде все-
го в гиппокампе [14]. В ряде экспериментов на животных стрессорные воздействия, вызывающие появление поведенческих симптомов депрессии, действительно сопровождались угнетением пролиферации и увеличением гибели нервных клеток в гиппокампе и
коре мозга. Эти процессы могут быть причиной уменьшения размеров отделов головного мозга, таких как гиппокамп, кора и миндалина, у некоторых больных депрессией [14].
Согласно нейротрофической гипотезе [8] эти изменения, вызываемые стрессорным воздействием и приводящие к развитию депрессии, могут затрагивать мозговой нейротрофи-ческий фактор (brain-derived neurotrophic factor, BDNF), играющий важную роль в регуляции пролиферации и жизнеспособности нейронов [23]. Во многих исследованиях действие стрессоров сопровождалось снижением экспрессии гена и белка BDNF в гиппо-кампе [9, 29], а введение нейротрофина непосредственно в эту структуру оказывало анти-депрессантный эффект [26]. Вместе с тем в ряде работ стрессорные воздействия хотя и провоцировали развитие депрессивноподоб-ного состояния, однако не только не снижали экспрессию BDNF в гиппокампе [4], но, более того, даже ее увеличивали [4, 24]. Кроме того, было обнаружено, что экспериментально вызванное снижение экспрессии фактора в гип-покампе оказалось само по себе недостаточным для появления поведенческих симптомов депрессии [1].
Помимо BDNF в контроль жизнеспособности нейронов вовлекается также антиапоптоз-ный белок Bcl-xl [6]. Показано, например, что вызванная острым стрессом гибель нейронов предотвращалась повышением экспрессии этого белка [20]. Экспрессия гена Bcl-xl, как было недавно обнаружено, может меняться в результате хронического стрессорного воздействия [13], однако сопряжение этих изменений с поведенческими симптомами депрессии остается неясным. В связи с этим в настоящей работе на взрослых самцах крыс было исследовано влияние однократного и повторного стресса вынужденного плавания на экспрессию генов BDNF и Bcl-xl в гиппокампе, фронтальной коре и миндалине в сопоставлении с выраженностью индуцированного стрессом депрессивноподобного состояния.
МЕТОДИКА
В работе использовали 30 взрослых самцов крыс линии Вистар массой 220—240 г. Животных содержали в течение эксперимента по одному в клетке в стандартных условиях вивария ИЦиГ СО РАН: при температуре 22— 24°С, естественном освещении и свободном доступе к воде и корму. В работе соблюдались
"Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных" (приказ Минздрава СССР № 755 от 12 августа 1977 г.).
Процедура стрессирования и оценки депрес-сивноподобного поведения животных. В качестве стрессорного воздействия был использован стандартный протокол теста вынужденного плавания [21]. Этот тест состоит из 15-минутного претеста и последующего за ним через сутки 5-минутного теста, во время которых животное помещали в стеклянный цилиндр (46 х х 20 см), наполненный водой до высоты 30 см. Помещение животного в воду вначале активирует попытки выбраться, затем эта активация сменяется пассивным поведением, характеризующимся только движениями, необходимыми для поддерживания головы над водой. Эпизоды активного и пассивного поведения чередуются в течение пребывания животного в воде. Поведение регистрировали с помощью видеокамеры. В дальнейшем определяли суммарную продолжительность пассивного поведения. После окончания каждой процедуры вынужденного плавания животных тщательно вытирали и возвращали в домашние клетки. 10 животных были исследованы через сутки после первого стрессирования (претеста), еще 10 крыс — через сутки после повторного стресса (теста). Контролем служили 10 животных, которых не подвергали плаванию. У животных после декапитации быстро выделяли на холоде гиппокамп, фронтальную кору и миндалину. Образцы ткани мозга хранили в жидком азоте до определения в них мРНК BDNF и антиапо-птозного белка Bcl-xl. В собранной после декапитации плазме крови определяли уровень кортикостерона иммуноферментным методом (Assay Designs, Inc., USA).
Анализ мРНК BDNF и Bcl-xl. Для определения матричной РНК (мРНК) BDNF, Bcl-xl и гена сравнения ß-актина в образцах ткани мозга был использован метод полуколичественной ревертивной полимеразной цепной реакции (ПЦР) [17]. Комплиментарная ДНК (кДНК) была получена с использованием oligo(dT)-праймера и обратной транскриптазы MuLV (СибЭнзим, Россия) из тотальной РНК, выделенной из образцов мозга (7—8 в группе) одноступенчатым гуанидин-изотиоционатным методом. Амплификацию специфичных для каждого гена участков кДНК проводили на приборе MasterCycler Gradient (Eppendorf AG, Германия) с использованием праймеров 5'-cgacgtccctggctggacactttt-3' и 5'-agtaagggcccgaacat-acgattgg-3' для BDNF [5], 5'-gtgccatcaatggcaac-
А
BDNF ß-актин
Б
140
120
* 100 F N Q 80 B
Д 60
Рч
* 40 20 0
БЕРЕЗОВА и др. 3 12 3
123 HIPP
1 2 3 CORT
2 3
1 2 3 AMYG
1
Рис. 1. Экспрессия гена BDNF в гиппокампе (HIPP), фронтальной коре (CORT) и миндалине (AMYG) у контрольных животных (1), а также через 24 ч после однократного (2) и повторного (3) стресса вынужденного плавания. А — электрофореграммы продуктов ПЦР BDNF и Р-актина. Б — уровень мРНК BDNF (в процентах по отношению к уровню у контрольных животных, представленному как 100%). * — p < 0.05 по сравнению с контролем; # — p < 0.05 по сравнению с уровнем через 24 ч после претеста.
Fig. 1. Effects of a single and repeated forced swim stress on BDNF mRNA expression in the rats hippocampus (HIPP), frontal cortex (CORT) and amygdala (AMYG). A — representative examples of RT-PCR bands corresponding to BDNF and beta-actin mRNAs of each animal group are shown. Б — BDNF mRNA data are expressed as mean (±SEM) percentage of control (=100%). 1 — untested control, 2 — at 24 h after pretest session, 3 — at 24 h after test session. * — p < 0.05 compared with untested controls; # — p < 0.05 compared with levels at 24 h after pretest session.
ccat-3' и 5,-ccgccgttctcctggatccaa-3, для Bcl-xl [25] и 5'-cgtgaaaagatcacccagat-3' и 5'-attgccgatagtgat-gacct-3' для ß-актина [19]. Для каждой пары праймеров количество циклов амплификации при выбранном температурно-временном режиме соответствовало экспоненциальной фазе нарастания оптически выявляемого продукта ПРЦ. Уровень мРНК BDNF и Bcl-xl оценивали методом компьютерной денситометрии (Scion Image; Scion Corporation, 2000, США) относительно уровня мРНК ß-актина после сканирования в ультрафиолете продуктов ПЦР (BioDoc II, Biometra GmbH, Германия), разделенных электрофорезом в 1.5%-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием.
Статистическая обработка результатов. Данные обрабатывали с применением t-кри-терия Стьюдента, однофакторного дисперсионного анализа (one-way ANOVA) с последующими парными post hoc-сравнениями от-
дельных групп, а также корреляционного анализа (по Пирсону).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
В 5-минутном тесте вынужденного плавания наблюдалось значительное увеличение продолжительности пассивного поведения по сравнению с аналогичным поведением тех же животных за первые 5 мин претеста (претест — 161.4 ± 7.6 с, тест - 189.8 ± 11.2 с,р < 0.05).
Через 24 ч после прет
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.