РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2007, том 47, № 2, с. 247-249
УЛЬТРАФИОЛЕТОВОЕ ^^^^^^^^^^^^^^ ИЗЛУЧЕНИЕ
УДК 535-31:557.346:576.34
ПОВРЕЖДАЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ДИГИТОНИНА НА КЛЕТОЧНЫЕ МЕМБРАНЫ МАКРОФАГОВ, ПОДВЕРГНУТЫХ ВОЗДЕЙСТВИЮ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ИЗЛУЧЕНИЯ
© 2007 г. С. К. Пирутин, В. Б. Туровецкий*, А. Б. Дружко, Ю. Б. Кудряшов
Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, Биологический факультет, Москва Институт экспериментальной и теоретической биофизики РАН, Пущино
Облучение макрофагов в дозе 4.6 Дж/см2 (^ах = 306 нм) приводит к появлению в их популяции незначительного количества поврежденных клеток, существенно не изменяющегося в ходе 60 мин темновой инкубации. Действие детергента дигитонина (без облучения) в концентрации 3 мкг/мл также не приводит к значительному повреждению клеточных мембран. Получен результат совместного действия ультрафиолетового (УФ) излучения и дигитонина, добавленного после облучения за 15 мин до измерения числа поврежденных клеток в препарате. Показано, что 15-минутная инкубация макрофагов после облучения приводит к повреждению клеток, вдвое превосходящему сумму повреждений, вызванных отдельно УФ-излучением (4.6 Дж/см2) и дигитонином (3 мкг/мл). В то же время суммарный уровень повреждения, наблюдавшийся в районе 30-й минуты после окончания облучения, не превышает суммы эффектов раздельного действия этих факторов. При дальнейшем увеличении пострадиационного времени вновь наблюдается синергический эффект.
Ультрафиолетовое излучение, повреждение мембран, перитонеальные макрофаги, дигитонин, перекисное фотоокисление липидов.
Проблема механизмов повреждающего действия ультрафиолетового (УФ) излучения представляет значительный интерес для современной фотобиологии и медицины. Большое количество работ посвящено изучению повреждающего действия средневолнового УФ-излучения (УФВ) на организменном, тканевом и клеточном уровнях [1-6]. В этом обилии работ важное место занимают исследования клеточных механизмов индуцированного УФ-повреждения. Значительная роль в повреждающем действии УФВ на клетки при достаточно больших дозах за короткое время после облучения принадлежит повреждению клеточной мембраны [7].
Как известно, важную роль в повреждении клеточных мембран УФ-излучением играет процесс перекисного фотоокисления липидов [8], однако остается еще много вопросов. Особый интерес в этом плане представляют данные об изменении свойств мембран клеток, подвергнутых облучению в дозах, близких к вызывающим нарушение их целостности. При анализе механизмов повреждающего действия УФ-излучения удобно использовать в качестве модельной системы макрофаги - клетки-фагоциты, участвующие в обеспечении иммунного гомеостаза организма, способные к быстро-
* Адресат для корреспонденции: 119899 Москва, Воробьевы Горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики; тел.: (495) 939-51-50; e-mail: vbturovet@rambler.ru.
му функциональному ответу на различные воздействия [9].
В связи с изложенным выше цель настоящей работы - изучение влияния детергента дигитонина в низкой концентрации (3 мкг/мл) на перитонеальные макрофаги, подвергнутые воздействию УФ-излучения в дозах, не вызывающих повреждения их плазматических мембран.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Объектом исследования служили перитонеальные макрофаги беспородных белых мышей. Для их получения животных забивали с помощью цервикальной дислокации, в брюшную полость вводили по 2 мл раствора Хенкса (содержавшего 10 ммоль/л HEPEs с рН 7.2; "Serva") и через несколько минут извлекали перитонеальную жидкость, обогащенную макрофагами. Подготовку препаратов клеток на покровных стеклах проводили, как описано ранее [10]. В работе использовали люминесцентный микроскоп "ЛЮМАМ ИЗ" ("ЛОМО", Ленинград). Возбуждение флуоресценции препаратов осуществляли с использованием галогенной лампы накаливания "КГМ 9-70" и комбинации стеклянных светофильтров "ФС 1-4" и "СЗС 21-2". Определение целостности плазматической мембраны макрофагов осуществляли, используя перекрестную окраску двумя флуоресцентными зондами: бромистым этидием и флуо-
248
ПИРУТИН и др.
Количество поврежденных клеток, % 80
1
70^ __ 2 60 50 40 30 20 10
Л
Дигитонин 3 мкг/мл
30 40 50 60 70 Время после облучения, мин
Влияние дигитонина на плазматические мембраны УФ-облученных макрофагов.
По оси абсцисс - время инкубации клеток после завершения их УФ-облучения в отсутствие (1) и в присутствии дигитонина в концентрации 3 мкг/мл (2). По оси ординат - отношение числа клеток с поврежденной плазматической мембраной к общему числу исследованных клеток (%). Пунктирной линией показано относительное содержание поврежденных клеток в популяции макрофагов при их 15-минутной инкубации в присутствии дигитонина (3 мкг/мл).
ресцеиндиацетатом ("Serva") в конечной концентрации 5 мкг/мл [10]. Клетки с неповрежденной мембраной определяли по зеленой флуоресценции флуоресцеина. При повреждении мембраны в клетки проникал этидиум бромид и, связываясь с ядерной ДНК, приводил к красному окрашиванию клеток [11].
В качестве источника УФ-излучения использовали лабораторный спектральный облучатель "ЛОС-2" (СКБ БП АН СССР, Пущино). Облучение клеток проводили при интенсивности излучения 10 мВт/см2 в дозе 4.6 Дж/см2 через интерференционный светофильтр с максимумом пропускания при X = 306 нм в комбинации со стеклянным светофильтром "УФС-5" для дополнительного подавления красной компоненты. Для измерения интенсивности падающего на объект излучения использовали УФ-радиометр "Аргус-03" (ГНМЦ ВНИИ ОФИ, Москва). Детергент дигитонин (3 мкг/мл) вводили в среду инкубации вместе с флуоресцентными зондами за 15 мин до начала подсчета количества поврежденных клеток.
Эксперименты проводили при температуре 22°С. В качестве среды инкубации использовали раствор Хенкса, содержавший 10 ммоль/л HEPES с pH 7.2 ("Serva"). Полученные данные представлены в виде средних арифметических значений исследованных параметров и их среднеквадратичных ошибок. Результаты экспериментов обработаны статистически с использованием критерия Стьюдента. Различия между средними ариф-
метическими значениями параметров считали достоверными при p < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Как было показано нами ранее [10], облучение макрофагов в дозах от 0.5 до 3.0 Дж/см2 не вызывает повреждения их плазматических мембран и не приводит к развитию повреждений в течение по крайней мере первых 50 мин темновой инкубации клеток после облучения. Повышение дозы облучения до 4-5 Дж/см2 сопровождается формированием "скрытых" повреждений мембран, а начиная с дозы 6 Дж/см2 выявляются явные нарушения их целостности.
Основываясь на этих данных, в наших экспериментах УФ-облучение клеток проводили в дозе 4.6 Дж/см2.
Как видно из данных, представленных на рис. 1 (кривая 1), облучение макрофагов в дозе 4.6 Дж/см2 приводит к появлению в их популяции незначительного количества поврежденных клеток, существенно не изменяющегося в ходе 60 мин темновой инкубации. Из рисунка также видно, что действие детергента дигитонина (без облучения) в концентрации 3 мкг/мл сопровождается повреждением около 8% клеток (пунктирная линия). Кривая 2 отражает результат совместного действия УФ-излучения и дигитонина, добавленного после облучения за 15 мин до измерения числа поврежденных клеток в препарате. Как видно, 15-минутная инкубация макрофагов после облучения приводит к повреждению клеток, вдвое превосходящему по величине сумму повреждений, вызванных отдельно УФ-излучением (4.6 Дж/см2) и дигитонином (3 мкг/мл). В то же время суммарный уровень повреждения клеточных мембран, наблюдавшийся в районе 30-й минуты после окончания облучения, не превышает суммы эффектов раздельного действия этих факторов. При увеличении пострадиационного времени до 45 мин вновь наблюдается синергический эффект, который приобретает еще более выраженный характер (примерно в 5 раз) через 60 мин после облучения макрофагов. Таким образом, в районе 30-й минуты после облучения макрофагов наблюдается явное снижение их чувствительности к повреждающему действию дигитонина.
Данные, полученные нами ранее [10], позволили предположить, что в результате процессов пе-рекисного фотоокисления в липидной фракции мембраны макрофагов, подвергшихся УФ-облу-чению в интервале доз от 4 до 5 Дж/см2, возникают дефекты. Эти дефекты при добавлении детергента в небольшой концентрации (3-4.5 мкг/мл) разрастаются и, по-видимому, проходя стадию гидрофильной поры, приводят к разрушению мембраны. При незначительном количестве фо-
РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ том 47 < 2 2007
ПОВРЕЖДАЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ДИГИТОНИНА НА КЛЕТОЧНЫЕ МЕМБРАНЫ
249
тоокисленных молекул фосфолипидов дигитонин в использованной концентрации не вызывает значительных повреждений.
Увеличение времени темновой пострадиационной инкубации клеток сопровождается, по-видимому, возрастанием содержания в их мембране окисленных липидных молекул, что приводит к возрастанию повреждающего эффекта дигито-нина к 60-й минуте инкубации (кривая 2). Сложнее объяснить факт снижения повреждающего эффекта дигитонина в районе 30-й минуты темновой инкубации макрофагов после облучения. На сегодняшний день можно лишь предположить, что к этому моменту происходит временное снижение содержания в мембранах УФ-облучен-ных клеток продуктов липидного переокисления. Судя по имеющимся в литературе данным, этот эффект можно объяснить возрастанием в эти сроки процессов репарации мембран [12-18], а также увеличением активности антиоксидантных систем в результате развития адаптационного ответа клетки на действие стрессирующего фактора [19]. В более поздние сроки пострадиационной темновой инкубации клеток происходит, по-видимому, снижение активности соответствующих систем и, как следствие, возрастает повреждающий эффект дигитонина.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Punnonen K, Leholta K, Autio P. et al. // Free Radic.
Biol. Med. 1995. V. 19. № 3. P. 235-41.
2. Soter N.A. // Semin. Dermatol. 1990. V. 9. № 1. P. 1115.
3. Perez S, Sergent O, Morel P. et al. // C. R. Seances Soc.
Biol. Fil. 1995. V. 189 № 3. P. 453-465.
4. Morliere P., Moysan A., Tirache
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.