ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 462, № 6, с. 716-718
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 611.438:612.017.12:577.21
ПОВЫШЕНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ rag1 И гйг В ТИМУСЕ В ОТВЕТ НА ИММУНИЗАЦИЮ © 2015 г. К. А. Васильев, А. В. Полевщиков
Представлено академиком РАН В.А. Черешневым 26.08.2014 г. Поступило 22.09.2014 г.
БО1: 10.7868/80869565215180231
Тимус является центральным органом иммунной системы, отвечающим за дифференцировку, селекцию и созревание Т-лимфоцитов. Долгое время считалось, что данные процессы осуществляются антигеннезависимо, благодаря наличию в органе гематотимического барьера. Однако большое количество экспериментальных работ указывает на проницаемость данной структуры для различных веществ [1—3]. В связи с этим актуальной становится задача оценки влияния ксеноантиге-нов на процесс созревания Т-лимфоцитов [4, 5].
Генетическая реаранжировка Т-клеточного рецептора (TCR) обеспечивается в основном ферментами RAG и TdT [4, 6]. Повышение экспрессии их генов указывает на формирование новых TCR [7], поэтому целью данной работы была оценка уровня экспрессии генов ragl и tdt в клетках тимуса мыши в ответ на иммунизацию.
В работе использовали самок белых нелинейных мышей массой тела 19—23 г в возрасте 8— 10 недель. Животных содержали в стандартных условиях вивария без ограничений в доступе к воде и корму. Работу с животными проводили в соответствии с правилами комиссии по биоэтике НИИ экспериментальной медицины РАМН.
Мыши были разделены на две группы. Мышей группы 1 иммунизировали внутрибрюшинно фе-тальной бычьей сывороткой в объеме 0.1 мл, контрольные животные получали равный объем физиологического раствора (0.14 M раствор NaCl). Все животные группы 2 за 72 ч до опыта получали внутрибрюшинно 1 мл 1%-го раствора декстрана (М. м. 60—80 кДа, "Valeant Pharmaceuticals Inter-
Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Российской академии медицинских наук, Санкт-Петербург E-mail: alexpol512@yandex.ru
Санкт-Петербургский государственный университет Дальневосточный федеральный университет, Владивосток
national", США) в качестве адъюванта с последующей иммунизацией по указанной схеме. Животных выводили из опыта ежедневно в течение 6 сут после иммунизации путем декапитации и извлекали тимус. Число животных при каждом измерении в опытных и контрольных группах было равно 4.
Выделение тотальной РНК и постановка реакции обратной транскрипции. Выделение РНК из клеток тимуса проводили при помощи реагента Extract RNA ("Евроген", Россия) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию РНК определяли при помощи фотометра Synergy HT ("BioTek Instruments, Inc.", США). Для обратной транскрипции использовали набор MMLV RT kit ("Евроген") с праймерами олиго-^'Г) по инструкции производителя. При постановке реакции брали 2 мкг РНК на одно определение. Реакцию проводили с помощью амплификатора Терцик ("ДНК-Технология", Россия) в течение 90 мин при температуре 42°С. Для остановки реакции смесь прогревали 10 мин при 70° С.
ПЦР в реальном времени осуществляли с помощью набора для ПЦР-РВ ("Синтол", Россия). Для подбора праймеров использовали программу Primer3 (Whitehead Institute for Biomedical Research, США). Для предотвращения амплификации геномной ДНК последовательность 3'-прай-меров подбирали так, чтобы ее часть располагалась на стыке двух экзонов. Для проведения реакции использовали следующие значения: денатурация — 95°C 300 c, затем 40 циклов при 95°C 25 с и 60° C 45 с. В качестве внутреннего стандарта использовали мРНК Р-актина. Уровень экспрессии генов "интереса" (ГИ) в опытных группах по сравнению со своим контролем рассчитывали по формуле 2-ААС1, где AACt = [ОТИ (опыт) - Ctp-act (опыт)] — [(ОГИ (контроль) — Ctp-act (контроль)] с вычислением среднего значения четырех повторов.
На рис. 1 приведены результаты оценки экспрессии генов rag1 и tdt. Динамика экспрессии этих генов совпадает: наиболее выраженные из-
ПОВЫШЕНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
717
2.0 г
123456 123456
3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0
Рис. 1. Динамика экспрессии генов rag1 и tdt. Здесь и на рис. 2 по оси абсцисс — время после иммунизации, сут, по оси ординат — уровень экспрессии генов относительно уровня в контроле на соответствующем сроке, принятого за 1; М± т. Число наблюдений по каждой точке равно 16. Темно-серые столбики — экспрессия rag1, светло-серые столбики — экспрессия tdt.
менения у животных опытной группы 1 происходят через 3 сут после иммунизации, когда экспрессия генов возрастает в 2—2.5 раза, и через 5 сут, когда происходит снижение экспрессии обоих генов. На 6-е сут уровень экспрессии генов приближается к уровню контроля (1.0).
На рис. 2 представлены результаты, полученные у мышей группы 2. Как и в случае группы 1, на ранних сроках происходит усиление экспрессии обоих генов, затем постепенное снижение, а на более поздних сроках — выравнивание показателей. Полученные для группы 2 данные свидетельствуют о сходной динамике экспрессии генов rag1 и tdt после иммунизации с предварительным введением декстрана, однако наибольших и наименьших значений данные показатели в группе 2 принимают через 2 и 4 сут соответственно, т.е. на 1 сут раньше, чем в опытной группе 1.
Полученные результаты указывают на изменение экспрессии генов rag1 и tdt в тимусе в ответ на антигенную стимуляцию. Это согласуется с литературными данными о способности тимуса отвечать на введение ксеноантигена [8, 9]. Данное обстоятельство представляется важным, так как современная теория рассматривает тимус как орган, не участвующий в иммунном ответе из-за наличия гематотимического барьера, непроницаемость которого для ксеноантигенов носит, тем не менее, весьма относительный характер [10].
Следует отметить, что экспрессия генов rag1 и tdt в тимусе осуществляется только в развивающихся Т-лимфоцитах, но не в клетках стромы. Ре-аранжировка Р-цепи ТСЯ происходит на стадиях DN2-3, в то время как реаранжировка а-цепи ТСЯ носит отложенный характер и происходит фактически при переходе от DP- к 8Р-тимоцитам. Функци-
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 462 № 6 2015
Рис. 2. Динамика экспрессии генов ragl и tdt в тимусе
мышей после предстимуляции декстраном.
ональное значение поздней реаранжировки а-цепи остается дискуссионным, особенно в свете данных о возможности ее повторной реаранжировки [4].
Предполагается, что селекционные события в ходе дифференцировки, обретение а-цепи TCR и переход от незрелого DP- к зрелому SP-Т-лимфо-циту происходят в процессе одного взаимодействия с внутритимической антигенпрезентирующей клеткой (АПК) [11]. В качестве этой АПК рассматриваются как клетки кортикального тимического эпителия, так и АПК медуллы (дендритные клетки и макрофаги), которые могут быть резидентами тимуса либо проникать в орган из крови после захвата антигена [12]. В этой связи совершенно новую трактовку получает ускорение экспрессии генов rag и tdt после стимуляции животных декстраном, использованным в качестве адъюванта (рис. 2). Этот результат указывает на участие внетимических АПК в созревании Т-лимфоцитов.
В этом случае есть основания предполагать, что процесс формирования TCR включает два этапа: антигеннезависимый, связанный с протекающей в более изолированном кортексе реаран-жировкой ß-цепи, и антигензависимый, протекающий на кортикально-медуллярной границе или в медулле и связанный с реаранжировкой а-цепи. В рамках этой гипотезы процесс селекции Т-лим-фоцитов в отношении некоего абстрактного ауто-антигена сменяется на процесс направленной селекции TCR в отношении конкретного ксеноантигена, что приводит к выделению нового — антигензависимого — этапа дифференцировки Т-клеток.
В целом можно заключить, что предшественники Т-лимфоцитов отвечают на введение ксено-антигена повышением экспрессии генов ragl и tdt, при этом предварительная стимуляция фагоцитов ускоряет этот процесс. Не исключено, что эти результаты могут привести к существенной корректировке представлений о процессе созре-
718
ВАСИЛЬЕВ, ПОЛЕВЩИКОВ
вания и дифференцировки Т-лимфоцитов и им-мунофизиологии тимуса в целом.
Работа выполнена при финансовой поддержке программы №1326 и гранта 14—08—06—25_и Дальневосточного федерального университета и гранта РФФИ № 15-04-05093а.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Blau J.N., Veall N. // Scand. J. Immunol. 1989. V. 8. P. 517-527.
2. Duijvestijn A.M., Hoefsmit E.C.M. // Cell and Tissue Res. 1981. V. 218. P. 279-292.
3. Kramarsky B., Siegler R., Rich MA. // J. Cell Biol. 1967. V. 1. P. 517-525.
4. Boehmer H., Aifantis I., Azogui O., Feinberg J., Saint-Ruf C., Zober C., Garcia C., Buer J. // Immunol. Rev. 1998. V. 165. P. 111-119.
5. Hiom K., Gellert M. // Cell. 1997. V. 88. P. 65-72.
6. MoX., Bailin T., Sadofsky M.J. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 7025-7031.
7. GellertM. // Annu. Rev. Biochem. 2002. V. 71. P. 101132.
8. Gossmann J., Löhler J., Lehmann-Grube F. // Immunology. 1991. V. 146. P. 293-297.
9. Kishimoto H, Sprent J. // J. Exp. Med. 1997. V. 185. P. 263-272.
10. Васильев К.А., Полевщиков А.В. // Биология моря. 2014. Т. 40. № 5. С. 331-341.
11. DzhagalovI., PheeH. // Cell. Mol. Life Sci. 2012. V. 69. P. 663-682.
12. Raviola E., Morris J., Karnovsky L. // J. Exp. Med. 1972. V. 136. P. 3466-3498.
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 462 № 6
2015
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.