ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 1, с. 102-110
УДК 581.1
ПОВЫШЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ ТРАНСГЕННЫХ ТОМАТОВ К ВОЗБУДИТЕЛЮ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ТОЧЕЧНОСТИ ПЛОДОВ
МЕТОДОМ ТРАНСФОРМАЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ Agrobacterium tumefaciens
© 2007 г. Н. К. Кок*, М. Кайим*, X. Етизир**, Н. Сари ***, С. Унлу Юсир*, С. Е. Арици*
* Университет Кукурова, факультет сельского хозяйства, кафедра защиты растений, Балкали, Адана, Турция ** Университет им. Мустафы Кемаля, факультет сельского хозяйства, кафедра растениеводства, Антакия, Турция *** Университет Кукурова, факультет сельского хозяйства, кафедра растениеводства, Адана, Турция
Поступила в редакцию 06.02.2006 г.
Ген pto, ответственный за устойчивость к Pseudomonas syringae pv. томат, переносили в томаты (Ly-copersicon esculentum L.) сорта Urfa-2 с помощью штамма LBA4404 Agrobacterium tumefaciens, несущего плазмиду pPTC8. Наличие генов nptII и pto в трансгенных растениях доказывали с помощью метода полимеразной цепной реакции. Вставку гена pto в геном трансгенных растений и его экспрессию подтверждали методами гибридизации по Саузерну и нозерн гибридизации, соответственно. Патогеном P. syringae pv. томат заражали все листья трансгенных и контрольных растений. В то время, как на листьях контрольных растений развивались типичные симптомы, характерные для болезни бактериальной точечности, у трансгенных растений при их инокуляции штаммами 1 и 0 не было выявлено ни одного симптома болезни. Некоторые из трансгенных растений имели листья, более толстые, чем у контрольных растений, и аномальные цветки. Трансгенные и контрольные растения перекрестно опылялись, давая трансгенные линии F1. После скрещивания трансгенных и контрольных растений были получены плоды, а семена F1 прорастали на МС-среде в присутствии канамицина и давали проростки Fl.
Lycopersicon esculentum - Agrobacterium tumefaciens - Pseudomonas syringae pv. томат - ген pto -трансгенное растение - бактериальная пятнистость
ВВЕДЕНИЕ
Традиционные методы растениеводства требуют больших временных затрат, и при их применении возможно введение в геном растений нежелательных характеристик. Хотя среди видов и разновидностей томатов встречаются устойчивые генотипы (несущие ген pto устойчивости к Pseudomonas syringae pv. томат), потомство, полученное скрещиванием этих устойчивых генотипов, может становиться чувствительным к органическим инсектицидам, в частности, к фентиону [1]. Это обусловлено тем, что наряду с геном pto,
Сокращения: ПЦР - полимеразная цепная реакция, AS -ацетосирингон; D1 - среда для индукции стеблеобразования; D2 - среда для удлинения стебля и формирования корня; nos -ген, кодирующий нопалинсинтазу; nptII - ген, кодирующий неомицинфосфотрансферазу II; pto - ген устойчивости к Pseudomonas syringae pv. томат.
Адрес для корреспонденции: Dr. N. Koc. University of Cukuro-va, Agricultural Faculty, Department of Plant Protection, Balcali, 01330, Adana, Turkey. Fax: +90 322-338-6047; e-mail: nkkoc@cu.edu.tr
в геном растений может встраиваться и ген fen, ответственный за данную неспецифическую чувствительность. Ген pto предположительно кодирует серин/треонин протеинкиназу, которая участвует в переносе сигнала от бактерий к клеткам растений. Ген pto обуславливает устойчивость к штаммам бактерий P. syringae pv. томат, вызывающих бактериальную точечность плодов, которые экспрессируют ген авирулентности (avr) avrPto [3], но похоже, что ген pto не несет чувствительности к фентиону [1]. Ген pto был выделен и клонирован из сорта дикого томата Lycopersicon pimpinellifolium [2]. После переноса гена pto в восприимчивый сорт томата Moneymarker [2] на листьях трансгенного растения не наблюдалось симптомов, типичных для бактериальной точечности плодов, что подтверждает, что ген pto обуславливает устойчивость к данному заболеванию. В данном исследовании, ген pto переносили в томаты сорта Urfa-2 с использованием Agrobacterium tumefaciens с целью достижения устойчивости к бактериальной пятнистости, вызываемой P. syringae pv. томат.
МЕТОДИКА
Растительный материал и условия выращивания. В качестве растительного материала использовали томаты (Lycopersicon esculentum L.) сорта Urfa-2. Семена стерилизовали в 70% этаноле в течение 1 мин, вымачивали в течение 10 мин в 10% растворе гипохлорита натрия, содержащего 0.1% Tween 20, затем 4 раза промывали стерильной дистиллированной водой для предотвращения потенциального бактериального заражения семян. Стерильные семена проращивали в куль-туральном сосуде с 40 мл модифицированной МС-среды, содержащей соли, витамин B5, 3% сахарозу и 0.75% агар ("Sigma", США), pH 5.8. Для создания постоянных условий внешней среды культуральные сосуды помещали в камеру для выращивания растений при температуре 25 ± 1°C с фотопериодом 16/8 ч (день/ночь) при интенсивности света 150 мкмоль/(м2 с).
Среда для инокуляции состояла из солей МС-среды, взятых в половинных концентрациях, витаминов МС-среды, 3% сахарозы с добавлением
1 мг/л ИУК и 20 мг/л ацетосирингона (AS) после автоклавирования. Среда для совместного культивирования состояла из солей МС-среды, витамина В5, 500 мг/л MES, 2 мг/л зеатина, 0.1 мг/л ИУК, 3% сахарозы и 0.75% агара ("Sigma"). Среда для стеблеобразования и селекции (D1) состояла из солей МС-среды, витамина В5, 500 мг/л MES,
2 мг/л зеатина, 3% сахарозы и 0.75% агара, а также в эту среду добавляли 50 мг/л канамицина для селекции трансгенных побегов и 300 мг/л карбе-нициллина для подавления бактериального роста. Среда для удлинения стебля и корнеобразования (D2) состояла из тех же компонентов, что и среда D1, но с уменьшенными концентрациями зеатина (0.2 мг/л) и канамицина (25 мг/л). pH каждой среды, за исключением среды для инокуляции, доводили до 5.7.
Штамм бактерий и вектор. В качестве векторной системы для трансформации использовали Agrobacterium tumefaciens штамма LBA4404, несущего бинарную плазмиду pPTC8. Данная плазмида содержала как ген nptlI (ген, кодирующий неомиц-инфосфотрансферазу II) под контролем nos промотора и nos терминатора транскрипции в качестве селекционного маркера, так и ген pto устойчивости к бактериальной пятнистости, под контролем промотора вируса мозаики цветной капусты 35S и терминатора транскрипции nos. Для выращивания отдельных колоний бактерии культивировали на твердой среде LB, содержавшей 200 мг/л стрептомицина и 50 мг/л канамици-на [4]. Несколько отдельных колоний переносили в 20 мл жидкой среды LB с теми же антибиотиками и культивировали на качалке при 28°C в течение ночи. На следующий день бактериальную суспензию разводили в объемном соотношении
1 : 40 в жидкой среде LB, содержащей антибиотики, и культивировали в течение 5-6 ч. Бактериальные клетки осаждали при 314 g в течение 10 мин, ресуспендировали и разводили до концентрации 1-2.5 х 107 клеток/мл в инокуляционной среде. Для измерения плотности суспензии использовали спектрофотометр ("Shimadzu UV-1208", Япония).
Трансформация и регенерация растений. Трансформацию эксплантов томатов проводили, как было описано ранее, согласно [5] с видоизменениями. Семядоли 10-дневных проростков были отрезаны и надрезаны со стороны черешка для бактериальной инокуляции. Перед инокуляцией эксплантов в инокуляционную среду добавляли ацетосирингон в концентрации 20 мг/л. Семядоли предынкубировали в среде D1 в течение двух дней, затем погружали в бактериальную суспензию на 10-15 мин и помещали на фильтровальную бумагу в чашку Петри. Экспланты переносили в среду для совместного культивирования и инкубировали в темноте в течение двух суток при 26 ± 1°C. Затем экспланты инкубировали на среде D1, содержащей 50 мг/л канамицина при той же температуре, но с фотопериодом 16/8 ч (день/ночь), после чего их пересаживали на свежую среду D1. Через два месяца регенерировавшие на среде D1 побеги переносили на среду D2 для их роста. Растения с ветвящимися корнями рассматривали как потенциальные трансформанты, так как корни не могут развиваться в присутствии 50 мг/л канамицина. Частоту трансформации рассчитывали как процент числа побегов, устойчивых к канами-цину, от общего числа эксплантов, инокулиро-ванных Agrobacterium [6]. Трансформанты с корнями пересаживали в горшки и выращивали в камере с фотопериодом 16/8 ч день/ночь и освещением от 180 до 270 мкЕ/(м2 с). Температура во время светового и темнового периодов была 26 ± 1°C и 21 ± 1°C соответственно.
ПЦР-анализ. Устойчивые к канамицину предположительно трансгенные растения анализировали на присутствие маркера (гена nptlI) и гена pto с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для гена nptlI использовали следующие праймеры: 5'-CAC GCA GGT TCT CCG GCC GC-3' (nptII-F) и 5'-TGG CGC TGC GAA TCG GGAGCG-3' (nptII-R). Для фрагмента гена pto длиной 1967 п.н. праймерами были следующие последовательности: 5'- CAT CCG CAT CTG GTT TCA TTG-3' (прямой) и 5'-CCA TCA CGC AAA ACA CCC CTG-3' (обратный). A. tumefaciens штамм LBA4404, несущий плазмиду pPTC8, использовали в качестве положительного контроля для генов pto и nptII; в качестве отрицательного контроля брали не-трансгенные растения сорта Urfa-2. ДНК трансгенных и контрольных растений выделяли упрощенным методом с использованием бромистого цетилтриметиламмония [7, 8]. ПЦР проводили следующим образом: 1 мкл ДНК добавляли к ре-
104
KOK и др.
акционной смеси общим объемом 25 мкл, содержащей по 2.5 мкл (1G мкМ) каждого праймера, G.2 мкл (одна единица) Taq полимеразы (Promega, Великобритания), 2.5 мкл 2.G мМ дезоксинуклео-тидтрифосфатов, 2.5 мкл буфера для и
13.8 мкл стерилизованной дистиллированной воды. Как для гена pto, так и для гена nptII использовали одинаковые параметры циклов ПЦP. Отличалась только температура отжига в первом и втором эксперименте: 64°C и 68°C соответственно. Программа ПЦP включала 3G циклов, состоящих из денатурации в течение 1 мин при 95°C, отжига в течение 1 мин при 68°C и синтеза в течение 1.5 мин при 72°C. Продукты ПЦP разделяли методом электрофореза в 1% агарозном геле при напряжении 8G В в течение 2 ч с последующим окрашиванием бромистым этидием, рассматривали в ультрафиолете и фотографировали цифровой камерой.
Caузepн и ii
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.